中國被毛孢分離鑒定及其PKS、NRPS功能基因的多樣性

任朝輝,牛曉娟,杜 靜,張傳博,*

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550001；2.遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，貴州遵義 536000)

冬蟲夏草[Ophiocordycepssinensis(syn.Cordycepssinensis)]是由冬蟲夏草菌(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc)寄生于鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲的幼蟲上所形成的僵蟲菌核與子座的蟲菌復(fù)合體[1-2],主要分布于青海、西藏、四川、云南等高寒地區(qū)[3],是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,與人參、鹿茸并稱“中藥三大寶”。現(xiàn)代藥理研究證明,冬蟲夏草具有調(diào)節(jié)免疫、降血糖血脂、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗輻射等廣泛的藥理作用[4-9]。中國被毛孢(Ophiocordycepssinensis)確定為冬蟲夏草的無性型[10-14],其發(fā)酵菌絲體具有與冬蟲夏草相似的藥理作用[15]。

隨著新的病原微生物及其耐藥性的不斷出現(xiàn),能否快速篩選到具有新結(jié)構(gòu)、新活性的微生物天然產(chǎn)物己成為新藥研究迫切解決的問題[16]。然而,微生物來源的天然產(chǎn)物一直是發(fā)現(xiàn)新型藥物先導(dǎo)化合物的重要來源之一,如今人們所使用的抗生素藥物絕大部分是由真菌、放線菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物及其衍生物,在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的用途,可用作抗生素、抗癌及抗病毒藥物等[17-18]。如:青霉素、洛伐他汀。

微生物次級代謝天然產(chǎn)物主要為聚酮類化合物(polyketide,PK)和肽類化合物(Nonribosonmal Peptide,NRP)2類,催化這些天然產(chǎn)物合成途徑的酶稱為聚酮合成酶(Polyketide synthase,PKS)和非核糖體多肽合成酶(Non-ribosonmal peptidesynthase,NRPS)[19]。PKS主要分為兩類,一類是復(fù)合PKS,即I型PKS,另外一類是芳香PKS,即II型PKS[20]。真菌大多數(shù)屬于I型PKS,即以模塊形式存在的多功能酶,主要由酮基合成酶(Ketosynthase,KS)、酰基轉(zhuǎn)移酶(Acyltransferase,AT)和酰基載體蛋白(Acylcarrier protein,ACP)3個核心功能域組成,其中,KS結(jié)構(gòu)域在整個PKS體系中序列最保守,適合設(shè)計簡并引物[21]。NRPS由腺苷酰化(Adenylation,A)結(jié)構(gòu)域、肽酰載體蛋白(Peptidyl carrier protein,PCP)結(jié)構(gòu)域和縮合(Condensation,C)結(jié)構(gòu)域3個核心結(jié)構(gòu)域組成[22],特定的結(jié)構(gòu)域具有特定的酶活性[23],NRPS由一系列的模塊順次排列組成,大多數(shù)NRPS的模塊數(shù)為3～15個,最高可達(dá)50個;模塊的數(shù)量、不同空間排列順序和底物特異性決定其最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)[24]。

目前,國內(nèi)外學(xué)者基于PKS和NRPS功能基因定向篩選的方法,獲得了豐富多樣的聚酮類和非核糖體多肽類化合物。如Bingle等[25]從不同真菌中獲得苯并吡喃酮聚酮合酶和甲基水楊酸合成酶的PKS片段;Wang等[26]利用PKS基因定向篩選技術(shù),發(fā)現(xiàn)了新聚酮類化合物Penicitriketo;Miao課題組[27]通過研究Streptomyces roseosporus NRRL 11379的NRPS合成途徑,首次克隆出達(dá)托霉素(Cubicin)合成基因簇,這些研究結(jié)果為從基因到新化合物的預(yù)測奠定了理論基礎(chǔ)。因此,從PKS和NRPS功能基因的克隆入手,從分子水平上篩選和預(yù)測菌株可能產(chǎn)生的化合物類型,發(fā)現(xiàn)新的聚酮類和非核糖體肽類化合物是有效可行的。

本研究以傳統(tǒng)名貴中藥材冬蟲夏草為材料,采用組織塊分離法進行冬蟲夏草無性型中國被毛孢菌種的分離,對該菌株進行發(fā)酵液抑菌活性檢測和多基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析,確定其分類地位;并對次級代謝產(chǎn)物合成基因PKS和NRPS進行了克隆與分析,以期為研究其次級代謝產(chǎn)物成分和功能提供分子生物學(xué)證據(jù),并為今后開發(fā)利用微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生冬蟲夏草 于2017年5～6月采至青海省果洛藏族自治州附近，海拔約4000～4500 m的高寒草甸地帶,采樣時將野生冬蟲夏草周圍10 cm的土壤一并挖起,放入無菌袋內(nèi),記錄樣品信息,并用冰盒迅速帶回實驗室,立即分離;中國被毛孢(Ophiocordycepssinensis) 菌株編號為ZG4-23;靶標(biāo)菌株:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞桿菌(Racillussubtilis)、大腸埃希菌(Escherichiacoli) 均由貴州師范大學(xué)微生物重點實驗室保藏;培養(yǎng)基 改良PDA培養(yǎng)基,LB固體培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;DNA marker、2×Taq PCR Master mix BioTeke公司;pMD19-T載體 日本TaKaRa公司;IPTG、X-Gal Solarbio公司;PCR擴增引物和克隆測序 上海生工生物工程公司完成;葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、胰蛋白胨、NaCl、牛肉膏等試劑 均為國產(chǎn)分析純。

DYCP-31DN型電泳儀 北京六一生物科技有限公司;BS97MyCycler PCR儀 Bio-Rad公司;HVE-50型高壓蒸汽滅菌鍋 HIRAYAMA公司;凝膠成像系統(tǒng) Bio-Rad Gel公司;TGL-16M型臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離與純化 菌株ZG4-23的分離采用組織塊分離法。取新鮮野生冬蟲夏草剝?nèi)ゾ?先用自來水沖洗20 min,用濾紙將表面水分吸干;再用75%酒精浸泡30 s,無菌水漂洗3次,5%次氯酸鈉浸泡3 min,無菌水漂洗3次。將消毒過的冬蟲夏草從子座基部切成子座和菌核(蟲體)兩個部分,用手術(shù)刀片切成2 mm×2 mm小塊后，接入事先準(zhǔn)備好的改良PDA培養(yǎng)基(含100 mg/mL鏈霉素和100 mg/mL青霉素);將平板置于17 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng);定期觀察培養(yǎng)皿上的菌落生長狀況,待從組織周圍長出氣生菌絲后,用無菌的接種環(huán)從菌落邊緣挑取菌絲，轉(zhuǎn)接到新的改良PDA培養(yǎng)基上進行純化。為了驗證表面消毒效果,取100 μL最后一次用于清洗表面消毒樣品的無菌水，涂布到改良PDA 培養(yǎng)基上,17 ℃培養(yǎng)以驗證表面消毒效果。

1.2.2 基因組DNA的提取及多基因序列的擴增 利用改良CTAB法[28]提取菌株ZG4-23的基因組DNA,電泳檢測后作為功能基因檢測及多基因序列擴增得模板。PCR反應(yīng)體系為50.0 μL:25.0 μL 2×TaqPCR Mix混合物,10.0 μmol/moL的正反引物各2.0 μL,2.0 μL DNA模板,19.0 μL ddH2O;本實驗共對3個DNA序列位點進行擴增和測序,包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS),大亞基(nrLSU)及延伸因子(TEF-1α),使用3對引物對不同位點進行擴增;其中,不同DNA基因片段的擴增條件及所需引物如表1所示。PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖磷膠電泳檢測,回收目的片段。

表1 PCR擴增引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.2.3 測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 將回收純化的目的片段和擴增引物送往上海英濰捷基生物技術(shù)公司完成測序,獲得多基因基因序列。將所得到的序列通過Blast程序,從GenBank、NCBI等公共數(shù)據(jù)庫中進行同源性分析,調(diào)出同源性最高且具有代表性菌株的序列,用clustalx進行序列比對,利用MEGA7.0軟件[29]、使用鄰接法[30](Neighbour-Joining)建立系統(tǒng)發(fā)育樹,并進行1000次重復(fù)檢驗,確定菌株ZG4-23的分類地位。

1.2.4 發(fā)酵液的制備 將純化后的菌株ZG4-23菌絲體用無菌接種鏟接種于液體改良PDA培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為三角瓶總體積的1/3)17 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)20 d。將發(fā)酵液經(jīng)10000 r/min 離心10 min,取上清液濃縮至原體積的1/10體積,得發(fā)酵液濃縮液,備用。

1.2.5 抑菌活性試驗 采用雙層平板打孔法[31]測定抑菌活性。首先將配制好的含2.0%瓊脂的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約10 mL倒入培養(yǎng)皿中作為下層平板,冷卻之后,將含1.2%瓊脂的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基冷卻不燙手后,用無菌移液槍吸取1%體積的供試菌懸液加入到該培養(yǎng)基中,輕輕搖晃混勻,立即倒入下層平板上作為上層平板。待冷卻后,用無菌打孔器(直徑為6 mm)打孔,在孔徑中分別加入250 μL發(fā)酵液濃縮液,以等體積的改良PDA液體培養(yǎng)基作為空白對照(CK),實驗設(shè)3次重復(fù)。靜置30 min后,平板置于37 ℃培養(yǎng)1 d,測抑菌圈直徑,取平均值。

1.2.6PKS和NRPS功能基因檢測及分析PKS功能基因擴增引物為KAF1(5′-GARKSICAYGG IACIGGIAC-3′),KAR2(5′-CCAYTGIGCTCCYTGICC IGTRAA-3′)[32]。PKS擴增的反應(yīng)體系為30.0 μL:15.0 μL 2×Taq PCR Mix混合物,10.0 μmol/moL的引物各1.0 μL,2.0 μL DNA模板,11.0 μL ddH2O;PCR 擴增程序為:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35次循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存,用1%的瓊脂糖磷膠電泳檢驗PCR擴增產(chǎn)物的純度和片段大小。

NRPS功能基因擴增引物為AUG003(5′-CCGGCACCACCGGNAARCCHAA-3′),AUG006(5′-CCGGACCATGTCGCCNGTBYKRTA-3′)[33]。NRPS擴增的反應(yīng)體系為30.0 μL:15.0 μL 2×Taq PCR Mix混合物,10.0 μmol/moL的引物各1.0 μL,2.0 μL DNA模板,11.0 μL ddH2O;PCR 擴增程序為:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35次循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存,用1%的瓊脂糖磷膠電泳檢驗PCR擴增產(chǎn)物的純度和片段大小。

1.2.7 PCR產(chǎn)物回收及克隆 采用瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒回收PCR產(chǎn)物,純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接,然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取-80 ℃保存的100 μL感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α放置冰浴中至完全融化,加入5 μL連接產(chǎn)物,冰浴放置30 min,取出后42 ℃熱激60 s,加入1000 μL LB液體培養(yǎng)基于37 ℃振蕩培養(yǎng)2.5～3 h。取100 μL菌液涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基平板上,于37 ℃倒置過夜培養(yǎng),隨機挑選白色菌落，進行菌落直接PCR檢測,確認(rèn)載體中插入片段的長度大小(約700 bp)。提取陽性克隆的質(zhì)粒，送上海英濰捷基生物技術(shù)公司進行測序。

1.2.8 測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 獲得序列后,登錄NCBI官網(wǎng)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/),使用VecScreen 程序去除序列中的載體序列。利用BLASTx軟件，將獲得的PKS和NRPS基因序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列,在線進行序列的同源性比對。根據(jù)氨基酸序列同源性比對結(jié)果,選擇同源性最高，且具有代表性菌株的序列作參考,使用clustalx進行序列同源性比對,最終運用MEGA 7.0 軟件、采用鄰接法(Neighbour-Joining)分別構(gòu)建PKS和NRPS系統(tǒng)發(fā)育樹,并進行1000次重復(fù)檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面消毒結(jié)果評估

取100 μL最后一次用于清洗表面消毒冬蟲夏草子實體的無菌水，涂布于改良PDA培養(yǎng)基上,17 ℃培養(yǎng)10 d后,觀察發(fā)現(xiàn)沒有微生物的生長,因而可以認(rèn)定，分離得到的微生物為冬蟲夏草子實體內(nèi)生真菌,而非外界環(huán)境污染或冬蟲夏草子實體表面的真菌。

2.2 序列測定及系統(tǒng)進化樹分析

通過PCR擴增菌株ZG4-23的ITS區(qū),LSU區(qū)及TEF-1α基因片段,獲得目的基因片段分別為537、903和941 bp,與引物設(shè)計區(qū)域大小相符,且無明顯非特異性的擴增產(chǎn)物出現(xiàn),其瓊脂糖磷膠電泳結(jié)果見圖1所示。

圖1 ZG4-23菌株的18S rDNA PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of 18S rDNAPCR product of strain ZG4-23 注:M:2000 bp DNA Marker;1,2,3均為目的條帶(從左至右分別為:ITS區(qū),LSU區(qū)及TEF-1α基因的目的片段)。

將菌株ZG4-23的18S rDNA序列在NCBI中進行BLSAT比對,發(fā)現(xiàn)該序列與Ophiocordycepssinensis的18S rDNA序列同源性最高,相似對達(dá)99%。下載同源性較高菌株的18S rDNA基因序列,使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖2),從系統(tǒng)發(fā)育進化樹中可以看出,菌株ZG4-23與Ophiocordycepssinensis(EU570952)、Ophiocordycepssinensis(HM595977)、Ophiocordycepssinensis(HM595975)和Ophiocordycepssinensis(EU570950)聚為一支,自展值為98,表現(xiàn)出相當(dāng)近的親緣關(guān)系。

圖2 ZG4-23與參考菌株ITS rDNA序列構(gòu)建的NJ樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS gene sequence and reference strain ZG4-23 sequence

將該菌株LSUrDNA序列GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的真菌LSUrDNA序列進行BLSAT比對,經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，菌株ZG4-23的LSUrDNA序列與Ophiocordycepssinensis的LSUrDNA序列同源性最高,相似對達(dá)99%。從系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖3)中可以看出,菌株ZG4-23與Ophiocordycepssinensis(MF403013)、Ophiocordycepssinensis(AB067711)、Ophiocordycepssinensis(AB067705)和Ophiocordycepssinensis(HM595892)聚為一支,自展值為99,表現(xiàn)出相當(dāng)近的親緣關(guān)系。再將該菌株TEF-1αrDNA序列GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的真菌TEF-1αrDNA序列進行BLSAT比對,經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，菌株ZG4-23的TEF-1αrDNA序列與Ophiocordycepssinensis的TEF-1αrDNA序列相似對達(dá)99%,從系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖4)中可以看出,菌株ZG4-23與Ophiocordycepssinensis(KU239989)聚為一支,自展值為96,表現(xiàn)出相當(dāng)近的親緣關(guān)系。因此,鑒定該菌株ZG4-23為中國被毛孢(Ophiocordycepssinensis)。

圖3 ZG4-23與參考菌株LSU rDNA序列構(gòu)建的NJ樹Fig.3 Phylogenetic tree based on LSU gene sequence and reference strain ZG4-23 sequence

圖4 ZG4-23與參考菌株TEF-1α rDNA序列構(gòu)建的NJ樹Fig.4 Phylogenetic tree based on TEF-1α gene sequence and reference strain ZG4-23 sequence

2.3 抑菌試驗

采用雙層平板打孔法測定了菌株ZG4-23對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌活性(見表2)。由此得知,菌株ZG4-23對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較強的抑菌作用,說明該菌株ZG4-23能夠產(chǎn)生具有抑菌作用的代謝產(chǎn)物。

表2 菌株ZG4-23發(fā)酵液抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of fermentation broth of strain ZG4-23

2.4 菌株ZG4-23功能基因PKS和NRPS基因檢測和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用PCR擴增的方法,通過兼并引物分別擴增出了菌株ZG4-23功能基因PKS和NRPS的擴增產(chǎn)物。將擴增獲得的PKS功能基因中的KS結(jié)構(gòu)域基因片段和NRPS功能基因中的A結(jié)構(gòu)域基因片段進行克隆測序;分別將獲得的PKS和NRPS核苷酸序列，在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫將核苷酸序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列并BLAST搜索,從中下載同源性最高的蛋白序列,采用MEGA 7.0軟件,將菌株ZG4-23對應(yīng)的蛋白序列與下載的蛋白序列進行比對,以鄰接法(Neighbour-Joining)建立PKS和NRPS進化樹,分別如圖5和6所示。

圖5 ZG4-23 I型PKSs 氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 The phylogenetic tree of ZG4-23 based on type I PKSs amino acid sequences

本研究中得到的PKS功能基因均為I型PKS,其中KS結(jié)構(gòu)域基因序列長度為855 bp,編碼271個氨基酸,經(jīng)BLASTp比對，與Genbank數(shù)據(jù)庫中中國被毛孢Ophiocordycepssinensis(EQK99819.1)聚酮合成酶(PKS)KS結(jié)構(gòu)域同源性為99%,屬于蛇形蟲草屬。NRPS功能基因中的A 結(jié)構(gòu)域基因片段約為700 bp,經(jīng)比對,該片段與TrichophytonrubrumNRPS序列相似度為76%,能編碼233個氨基酸;從圖6可以看出,該蛋白序列單獨聚為一類,但與毛癬菌屬(Trichophytonsp.)的NRPS比較接近,表明該菌株的合成基因簇可能產(chǎn)生與毛癬菌屬(Trichophytonsp.)結(jié)構(gòu)相似的代謝產(chǎn)物,如雷帕霉素與他克莫司是結(jié)構(gòu)類似的化合物,但它們的合成基因簇聚成一束[34]。

圖6 ZG4-23 NRPSs氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.6 The phylogenetic tree of ZG4-23 based on NRPSs amino acid sequences

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的真菌分類學(xué)鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定,然而真菌種類的多樣性及環(huán)境的不穩(wěn)定性等諸多因素限制了這些方法的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,通過提取真菌基因組DNA,并對其ITS區(qū)、LSU區(qū)、TEF-1α基因片段進行PCR擴增,進行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，確定菌株的種屬地位,已成為現(xiàn)代真菌鑒定最為有效的方法。本實驗從野生冬蟲夏草中分離得到1株編號為ZG4-23的真菌,其抑菌活性較強;并對其多基因譜系分析菌株ZG4-23的ITS區(qū)、LSU區(qū)、TEF-1α基因片段進行研究,分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,菌株ZG4-23均與中國被毛孢(Ophiocordycepssinensis)聚在同一分支上,因此,鑒定該菌株為中國被毛孢。

功能基因檢測結(jié)果表明，菌株ZG4-23同時具有I型PKS和NRPS基因。I型PKS基因通常合成一些活性物質(zhì),尤其是具有抑菌活性的化合物或抗生素的前體,在生物防御中扮演著重要角色,本研究中菌株ZG4-23表現(xiàn)出較強的抑菌活性,這與實驗結(jié)果保持一致,這說明PKS基因可能與抑菌活性的化合物的合成有關(guān)。在真菌中,NRPS基因廣泛存在,王晗等[35]在黑茶的散囊菌屬(Eurotium)中檢測到NRPS基因片段的存在;極地微生物中也已發(fā)現(xiàn)NRPS基因的存在[36]。NRPS可應(yīng)用于多肽類抗生素、免疫抑制劑藥物、鐵載體、生物表面活性劑、抗癌藥物、細(xì)胞生長抑制劑和抗病毒藥物等[37],有著廣泛的應(yīng)用前景。而且,該菌株有編碼產(chǎn)生聚酮類和多肽類次生代謝產(chǎn)物的基因基礎(chǔ),還有可能通過不同雜合形式的PKS-NRPS介導(dǎo)合成更為復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物[38],如Pseurotin A,Pseurotin A是Aspergillusfumigatus產(chǎn)生的一種免疫抑制劑,其生物合成途徑中關(guān)鍵中間體Azaspirene來源于PKS-NRPS和甲基轉(zhuǎn)移酶催化形成的中間體[39-41]。因此,菌株ZG4-23是一株具有較高研究開發(fā)價值和應(yīng)用潛力。

同時,野生冬蟲夏草屬于我國瀕危藥用中藥材,本研究分離得到的菌株中國被毛孢與野生冬蟲夏草的藥理作用相似[15],可作為野生冬蟲夏草的替代品;因此,本研究結(jié)果可為野生冬蟲夏草生長環(huán)境特殊、資源緊缺等引起的藥源匱乏和生態(tài)環(huán)境破壞問題提供新思路,對瀕危藥用中藥材資源的保護具有重要意義。