不同來源異戊烯基焦磷酸異構酶(IDI)和脫氧木酮糖磷酸合成酶(DXS)對重組大腸桿菌番茄紅素產量的影響

楊 帆,蘇卜利,姚 青,李華平,朱紅惠,*

(1.廣東省微生物研究所,廣東省菌種保藏與應用重點實驗室,廣東省微生物應用新技術公共實驗室,省部共建華南應用微生物國家重點實驗室,廣東廣州 510070;2.華南農業大學農學院,廣東廣州 510642；3.華南農業大學園藝學院，廣東廣州 510642)

番茄紅素是一類含有40個碳原子的類胡蘿卜素,不僅具有很高的營養價值,而且具有保健功效,尤其是具有較高的抗氧化能力,能防治血管硬化、抗衰老及抑制癌細胞生長,在食品加工、醫藥保健、化妝品等行業用途十分廣泛[1]。目前,番茄紅素的生產方法主要包括以下幾種:a.天然產物提取獲得[2],例如從胡蘿卜、番茄等富含色素的植物中提取;b.利用化學法對番茄紅素進行全合成[3];c.采用三孢布拉氏霉菌、杜氏鹽藻、紅法夫酵母等天然具有番茄紅素合成能力的微生物進行發酵生產[4]。但這三種方法都有相應的不足之處,如天然提取成本較高,化學合成會產生副產物,天然菌株產量較低,故應用基因工程將外源基因導入模式菌株,利用模式菌株繁殖快、產量高、遺傳改造方便等特點制造番茄紅素是番茄紅素生產的主要發展方向[5]。和其他萜類化合物一樣,番茄紅素是以異戊烯焦磷酸(IPP)作為前體進行合成[6]。在自然界,有兩種途徑合成:MVA途徑和MEP途徑[7-9]。

異戊烯基焦磷酸異構酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)和脫氧木酮糖磷酸合成酶(1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase,DXS)是合成番茄紅素等萜類化合物的關鍵催化酶,也是代謝工程對萜類化合物合成途徑改造的最重要的靶點之一[10]。IDI編碼大腸桿菌代謝途徑中的IPP異構化酶,能夠促進1PP向DMAPP的轉化[11],通過在大腸桿菌中過表達idi基因，能夠有效提高番茄紅素產量。IDI在基因序列及反應機制上可以分為兩類,但兩類IDI在代謝改造中促進番茄紅素合成的作用仍不清楚。DXS編碼脫氧木酮糖磷酸合成酶,主要催化丙酮酸和三磷酸甘油醛之間的反應[12]。IDI、DXS在萜類化合物代謝途徑中發揮著重要的作用,不同來源IDI、DXS對工程菌株產番茄紅素的作用也各不相同。目前工程菌株中強化IDI、DXS的策略往往局限在大腸桿菌來源等自身不能生產番茄紅素的少數候選基因,而許多產番茄紅素菌株的IDI、DXS并沒有得到表征。

本課題組有一株能在極端環境下生存的戈壁奇球菌(Deinococcusgobiensis),該菌株菌落為紅色,基因組中含有合成番茄紅素的CrtE、CrtB和CrtI基因,通過生物信息學分析調取相關基因,經過密碼子優化構建了合成番茄紅素的重組大腸桿菌。通過對不同來源IDI、DXS進行異源過表達,探索其對工程菌株合成番茄紅素能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

表1 本研究使用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

Nexus GSX1 PCR儀 德國Eppendorf公司;5452型離心機 德國Eppendorf公司;1645050型電泳儀 北京六一生物科技有限公司;ChemiDoc MP凝膠成像系統 美國BIO-RAD公司;1200型高效液相色譜(HPLC) 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據大腸桿菌密碼子的偏好性,將戈壁奇球菌基因組中含有合成番茄紅素的CrtE、CrtB和CrtI基因進行密碼子優化，并添加合適的RBS位點,全基因合成CrtEBI基因。

以實驗室保存的基因組或空載體為模版,按表2中相應的配對引物,分別擴增得到載體pTrc99a、pACYCDuet-1片段,以及ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI和ECDXS、BSDXS、MXDXS、IODXS目的片段。其中,pTrc99a、pACYCDuet-1、E.C、B.S等基因的PCR擴增條件為:95 ℃預變性5 min;98 ℃變性10 s;55 ℃退火15 s;72 ℃延伸30 s;共進行30個PCR循環;最后在72 ℃繼續延伸10 min;M.X、I.O基因使用擴增高GC基因的PrimeSTAR? HS DNA Polymerase with GC Buffer進行擴增,PCR條件分別將退火溫度改為60、68 ℃。

表2 本研究使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.2 表達載體構建 將獲得的目的基因與載體片段進行瓊脂糖凝膠電泳,回收條帶。使用CPEC[13]的方法將CrtEBI基因與pTrc99a進行連接,并分別將不同IDI、DXS與pACYCDuet-1載體進行連接,構建重組質粒。連接體系為:目的基因與載體各2.5 μL、Primer Star Max DNA polymerase 5 μL。連接條件為:98 ℃預變性3 min;98 ℃變性10 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min后轉化E.coliDH5α。含pTrc99a載體的重組質粒在含34 mg/L氯霉素抗性的平板上進行篩選,含pACYCDuet-1載體的重組質粒在含100 mg/L氨芐青霉素抗性的平板上進行篩選。在37 ℃培養箱中培養約12 h后，挑取單菌落進行菌落PCR驗證,驗證引物為pTrc99a、pACYCDuet-1測序引物。將驗證正確的菌體在37 ℃搖床中培養約12 h后,使用質粒提取試劑盒提取質粒,送上海美吉公司進行測序,經測序正確的重組質粒分別命名為pTrc99aEBI、pACECIDI、pACBSIDI、pACMXIDI、pACIOIDI;pACECDXS、pACBSDXS、pACMXDXS、pACIODXS。

1.2.3 重組質粒的誘導表達 分別將質粒pACECIDI、pACBSIDI、pACMXIDI、pACIOIDI、pACECDXS、pACBSDXS、pACMXDXS、pACIODXS與含有番茄紅素合成基因的pTrc99aEBI質粒共同轉入E.coliBL21(DE3)中,同時以空pACYC質粒作為對照。在含有氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上進行篩選,得到相應的重組菌株。

挑取單克隆至5 mL含有氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養基,在37 ℃搖床中培養,待菌體長至OD600值大約1后,轉接至50 mL含有100 mg/L氨芐青霉素和34 mg/L氯霉素的LB液體培養基中。待菌體OD600值達到0.6～0.8時,用一定濃度的IPTG進行誘導,同時以未誘導的培養基作為對照,約20 h后檢測番茄紅素含量。

1.2.4 IDI與DXS的協同表達 根據大腸桿菌密碼子的偏好性,將粘細菌中的IDI及DXS進行優化,并通過全基因合成得到idi-dxs基因。通過CPEC方法將idi-dxs基因與載體片段pACYC進行連接,獲得質粒pACMYIDI-DXS。將質粒pACMYIDI-DXS與含有番茄紅素合成基因的pTrc99aEBI質粒共同轉入大腸桿菌BL21(DE3)中,得到相應的重組菌株。

1.2.5 番茄紅素的提取與測定 番茄紅素的提取與測定參照Sun等[14]方法。具體操作:取3 mL在LB液體培養基中培養至一定時期的菌液,5000 r/min離心3 min棄上清液;用無菌水清洗兩次,加3 mL丙酮,于55 ℃水浴鍋中萃取15 min,5000 r/min離心5 min，取上清即為番茄紅素萃取液,保留上清液以備檢測。另外取9 mL培養液于8000 r/min 離心5 min后棄上清液,沉淀于70 ℃中烘干,然后計算菌體干重。

考察學習中，考察團一行先后來到長治市武鄉八路軍紀念館和平順縣，進行重溫入黨誓詞，并聽全國勞動模范申紀蘭老人上黨課，接受愛國主義教育。同時結合此行考察重點，考察團還對長治市幾個鄉、縣的種植、養殖合作社、集體經濟示范村、鄉村旅游示范點的運營管理、農村“兩委”建設、民主管理、村委會民主監督等典型經驗進行了學習和交流。對長治市城區相關社區基層黨建和社會管理工作進行了深入了解。

番茄紅素含量的測定使用高效液相色譜儀(HPLC)。色譜柱:反相色譜柱C18;流動相為乙腈∶甲醇∶異丙醇(80∶15∶5,v∶v∶v),流速1.2 mL/min,檢測波長為472 nm,柱溫40 ℃,進樣量10 μL。使用番茄紅素標準品制作標準曲線,通過稀釋番茄紅素母液,配制了以下濃度番茄紅素樣品:18、16、14、12、6、4、2、1 mg/L,根據相應濃度番茄紅素樣品對應的峰面積,可以得到其標準曲線為:Y=0.0286X-0.1968,R2=0.9972,根據標準曲線計算番茄紅素的產量。

1.2.6 培養條件的優化

1.2.6.1 不同誘導劑濃度對菌株生產番茄紅素的影響 以LB培養基為基礎培養基,以含有pACMXDXS與pTrc99aEBI的菌株為優化對象。待菌體OD600值達到0.6～0.8時,用IPTG進行誘導,選用誘導劑終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2 mmol/L。

1.2.6.2 不同誘導時間對菌株生產番茄紅素的影響 以LB培養基為基礎培養基,以含有pACMXDXS與pTrc99aEBI的菌株為優化對象。待菌體OD600值達到0.6～0.8時,用IPTG進行誘導,選取誘導劑添加時間分別為2、3、4、5 h。

1.2.6.3 不同培養時間對菌株生產番茄紅素的影響 以LB培養基為基礎培養基,以含有pACMXDXS與pTrc99aEBI的菌株為優化對象。選取菌株培養時間分別為12、18、24、30 h提取番茄紅素。

1.3 數據處理

以上實驗分別重復2次,實驗數據處理采用Microsoft Office Excel 2007。

2 結果與分析

2.1 不同來源IDI基因與DXS基因的獲得

以本實驗室保存的基因組為模板,依次用表1中的引物,分別對ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI和ECDXS、BSDXS、MXDXS、IODXS各種來源的目的基因進行PCR擴增,已知的各個基因大小分別為549、1050、1059、912、1863、1902、1752、1845 bp。PCR結果與各個基因的大小吻合,所得的核酸電泳圖如圖1所示。

圖1 不同來源IDI、DXS PCR擴增產物核酸電泳圖Fig.1 Nucleic acid electrophoresis of the different IDI and DXS’s PCR products注:M.marker;1.ECIDI;2.BSIDI;3.MXIDI;4.IOIDI;5.ECDXS;6.BSDXS;7.MXDXS;8.IODXS。

2.2 重組質粒的構建

將合成番茄紅素CrtEBI基因及不同來源的4種idi、dxs基因分別插入質粒pTrc99a、pACYC,構建合成番茄紅素的99aEBI質粒及含有idi、dxs基因的多種質粒。將該質粒轉化E.coliDH5α,待培養后提取質粒送測序,測序結果用軟件Vector NT1進行比對,結果表明各個質粒均構建成功。

2.3 重組質粒的過表達及其對番茄紅素產量的影響

將含有番茄紅素合成基因的質粒與新構建的含有IDI、DXS的質粒共同轉入E.coliBL21(DE3)中,獲得含不同來源功能基因的菌株。重組菌株培養離心結果如圖2,表明過表達DXS和IDI后重組菌產番茄紅素能力有所提升。在過表達不同來源IDI、DXS基因后,重組菌株番茄紅素產量得到了不同程度的提高,結果如圖3、圖4。在重組菌株中,目的基因來源于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、粘細菌的菌株番茄紅素產量都有一定提升,添加誘導劑后，番茄紅素產量要明顯高于未添加誘導劑。

圖2 過表達DXS和IDI重組菌產番茄紅素情況Fig.2 Production of lycopene by strain with IDI注:A.對照菌株;B.過表達DXS的重組菌株;C.過表達IDI的重組菌株。

圖3 不同來源IDI對番茄紅素產量的影響Fig.3 Effects of IDIs on lycopene production 注:+表示添加IPTG進行誘導;圖4同。

圖4 不同來源DXS對番茄紅素產量的影響Fig.4 Effects of DXSs on lycopene production

表達ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI的菌株番茄紅素產量分別可以達到4.23、4.87、5.28、3.23 mg/g DCW。添加誘導劑IPTG后的菌株番茄紅素產量分別達到6.55、8.24、10.86、3.70 mg/g DCW,其中最高的M.XIDI比沒有轉化IDI的對照菌株產量(3.58 mg/g DCW)提高了約2.0倍。

表達ECDXS、BSDXS、MXDXS、IODXS的菌株番茄紅素產量分別可以達到4.88、2.79、3.18、3.03 mg/g DCW。添加誘導劑IPTG后的菌株番茄紅素產量分別達到5.19、4.33、7.94、4.07 mg/g DCW,其中最高的MXDXS比沒有轉化DXS的對照菌株產量(3.58 mg/g DCW)提高了約1.2倍。

2.4 IDI與DXS的協同表達對番茄紅素產量的影響

以上結果表明,相對于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等菌株,來自粘細菌的IDI、DXS對MEP途徑的強化具有更明顯的作用。為了構建高水平合成番茄紅素的大腸桿菌工程菌株,將粘細菌IDI及DXS進行密碼子優化獲得idi-dxs基因。通過協同表達IDI和DXS來進一步提高番茄紅素的合成水平。將質粒pACMYIDI-DXS和pTrc99aEBI轉化到E.coliBL21(DE3)中,獲得高水平合成番茄紅素的菌株。在LB培養基中培養3 h后，添加IPTG進行誘導,約20 h后提取番茄紅素。在協同表達IDI、DXS后,重組菌株番茄紅素產量得到最高,達到15.26 mg/g DCW,比沒有轉化IDI、DXS的對照菌株產量(3.58 mg/g DCW)提高了約3.3倍。

2.5 培養條件的優化

2.5.1 不同誘導劑濃度對菌株生產番茄紅素的影響 添加誘導劑可顯著影響菌株生產番茄紅素的能力。從圖5可以看出，工程菌在添加了不同濃度的誘導劑培養時,番茄紅素含量并沒有明顯差異,但終濃度為0.1、0.2 mmol/L的效果要稍好于其它濃度。

圖5 不同誘導劑濃度對番茄紅素產量的影響Fig.5 Effects of different inducerconcentration on lycopene production

2.5.2 不同誘導時間對菌株生產番茄紅素的影響 菌株生長到不同時間添加誘導劑可顯著影響菌株生產番茄紅素的能力。從圖6可以看出,菌株在生長3 h添加誘導劑時,番茄紅素含量最高,效果明顯好于其它時間。因此確定工程菌培養最適宜的誘導劑添加時間為培養3 h。

圖6 不同誘導時間對番茄紅素產量的影響Fig.6 Effects of different inducer time on lycopene production

2.5.3 不同培養時間對菌株生產番茄紅素的影響 不同發酵時間對于番茄紅素產量有著明顯的影響,從圖7可以看出,工程菌在培養24 h左右,番茄紅素含量達到最高。因此確定工程菌培養最適宜的發酵時間為24 h。

圖7 不同培養時間對番茄紅素產量的影響Fig.7 Effects of different incubation time on lycopene production

3 討論與結論

為達到利用大腸桿菌高效生產番茄紅素的目的,需要對番茄紅素的代謝途徑進行改造和優化[15]。其中,通過過表達番茄紅素代謝途徑中的關鍵酶基因,可以有效提高番茄紅素產量。IDI、DXS是合成番茄紅素等萜類化合物的關鍵催化酶,也是代謝工程對萜類化合物合成途徑改造的最重要的靶點之一[16]。Rad等[17]報道，II型IDI在大腸桿菌工程菌株中更有利于番茄紅素的合成,通過過表達II型枯草芽孢桿菌idi基因,將番茄紅素產量提高了約1.6倍;韓莉等[18]對2類IDI進行了系統性分析,通過優化多靶點組合及轉化時間將番茄紅素的產量提高到10.29 mg/g DCW。翁志明[19]通過對dxs基因啟動子的置換將番茄紅素的產量提高到15.6 mg/g DCW。本研究中,選取了典型的大腸桿菌及枯草芽孢桿菌IDI、DXS作為對照,選取了本身能生產番茄紅素的戈壁奇球菌和粘細菌的IDI、DXS,比較了不同來源IDI、DXS對番茄紅素產量的影響。

本研究結果顯示,II型的枯草芽孢桿菌idi基因對重組大腸桿菌合成番茄紅素能力的促進效果要優于I型的大腸桿菌idi基因,這與文獻[20]報道所一致,但其dxs基因的促進效果要比大腸桿菌差。而來自粘細菌的idi基因和dxs基因的促進效果都優于枯草芽孢桿菌和大腸桿菌。在發酵培養24 h后,番茄紅素產量達到10.86、7.94 mg/g DCW。協同表達經過優化后的idi-dxs基因,番茄紅素產量達到了15.26 mg/g DCW,比對照菌株提高了約3.3倍。由此可以說明,來自粘細菌的idi、dxs基因優于代謝工程改造中常用的基因。目前還未見報道利用粘細菌來源基因優化MEP途徑,提高番茄紅素產量。這為后續代謝工程改造提供了新的基因資源。

為了進一步提高番茄紅素產量,下一步的工作考慮把產番茄紅素基因及idi基因、dxs基因整合到基因組上,同時嘗試不同的啟動子和RBS位點來改造和優化代謝途徑。另外,進一步對產番茄紅素工程菌株進行培養條件的優化及高密度發酵培養,來提高番茄紅素產量。