火龍果花的體外抗氧化物提取工藝優化及其抗炎活性

張艷軍,廖日權,鄭云云,尹艷鎮,黃秋園,徐國鑫,黃恩交,朱靖清,吳彩麗

(欽州學院石油與化工學院,廣西高校北部灣石油天然氣資源有效利用重點實驗室,廣西欽州 535011)

火龍果(Pitaya)是仙人掌科,三角柱屬植物[1]?；瘕埞ò巳梭w必需的氨基酸、維生素、微量元素、膳食纖維、蛋白質、不飽和脂肪酸等多種營養成分,且其藥用成分廣泛,主要含黃酮、萜類、多酚類等活性物質[2-4]。火龍果花中特有的粘液,富含營養,具有較高藥用價值,能起到抑菌、消炎、清火、潤肺、止咳、增強免疫力、降血糖、降血脂、降血壓、抗癌、治療高尿酸癥等作用[5-7]。

近年來,學者們對火龍果花的研究較多,主要涉及火龍果花的干制[8]、保健飲料的制作[9]、營養成分的研究等[2]方面。周俊良等[10]以脫水火龍果花為原料,研制出蜂蜜火龍果花茶飲料的最佳配比工藝,在此條件下該茶飲料的感官評價分數高,滿足大眾口味。高慧穎等[11]探討超聲波輔助提取火龍果花多糖的工藝條件,多糖抗氧化活性的結果顯示，其具有較強的抗氧化活性。王琦等[12]探索了不同粉碎度、有機溶劑、溫度以及提取時間對火龍果花精油提取率的影響,確立了火龍果花精油的最佳提取工藝條件?；瘕埞ㄒ蛟谒幨硟煞矫娴膹V泛用途，具有較大的開發前景,而目前對火龍果花的體外抗氧化物提取工藝及抗炎活性的研究未見報道。

本文以火龍果花為研究對象,以乙醇為溶劑,先進行單因素實驗,在此基礎上采用正交試驗進行火龍果花體外抗氧化物提取工藝優化,尋求最佳的提取工藝條件;并對最佳工藝條件下的粗提物進行了體外抗炎活性研究。該研究旨在為火龍果花的開發利用奠定基礎和提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

火龍果干花 粉碎后過80目篩,至于干燥器中備用,廣西欽州市火龍果基地,粉碎,過80目篩,備用;DPPH(即二苯代苦味酰肼)、VC、LPS(脂多糖)、胰酶、MTT(噻唑藍) 美國Sigma公司;Hyclone DMEM培養基、血清 美國Gibco公司;RAW264.7小鼠巨噬細胞 中科院上海生命研究院;NO檢測試劑盒(Griess試劑Ⅰ和Griess試劑Ⅱ) 碧云天生物技術有限公司;乙醇、FeSO4、水楊酸、過氧化氫等 均為分析純。

T6型可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FB214C型電子天平 上海精密科學儀器有限公司;M1000型多功能酶標儀 瑞士tecan公司;311型CO2培養箱 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝 準確稱量火龍果花約2.0 g,在一定的溫度、液料比和一定濃度的乙醇中，回流提取一定的時間,磁力攪拌輔助,回流完成后趁熱抽濾,將濾液轉移至100 mL容量瓶中,并用同濃度乙醇定容,得到的待測樣品進行下一步的抗氧化活性測定。

1.2.2 單因素實驗設計 提取溫度對火龍果花提取物體外抗氧化活性的影響:預先設定料液比為1∶25 g/mL,乙醇濃度為75%,回流時間2 h,通過改變提取溫度,分別設定為45、55、65、75、85 ℃五個水平，來探究提取溫度對火龍果花提取液抗氧化活性的影響。料液比對火龍果花提取物體外抗氧化活性的影響:設定提取溫度75 ℃,乙醇濃度為75%,回流時間2h,通過改變料液比,分別設定為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL五個水平，來探究料液比對火龍果花提取液體外抗氧化活性的影響。提取時間對火龍果花提取物體外抗氧化活性的影響:設定溫度75 ℃和液料比1∶30 g/mL,乙醇濃度為75%,通過改變回流時間,分別設定為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h五個水平，來探究提取時間對火龍果花提取液抗氧化活性的影響。溶劑乙醇濃度對火龍果花提取物體外抗氧化活性的影響:設定溫度75 ℃,液料比1∶30 g/mL和時間3.0 h,通過改變溶劑乙醇濃度,分別設定為60%、70%、80%、90%、100%五個水平來探究溶劑乙醇濃度對火龍果花提取液體外抗氧化活性的影響。

1.2.3 正交試驗設計 根據火龍果花體外抗氧化活性單因素實驗結果,對影響火龍果花抗氧化活性的四個因素(提取溫度A,提取時間B,料液比C,乙醇濃度D)采用正交試驗法優化提取工藝,采用L9(34)正交表進行試驗,因素水平見表1。

表1 正交試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.4 體外抗氧化實驗

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的測定 參照文獻[13],取待測樣品各2 mL,分別加入2 mL 1.0×10-4mol/L DPPH,搖勻后暗室存放,30 min后,在517 nm測溶液的吸光值,并用空白液進行參比。每份樣品平行測定3次取平均值。由所測得的吸光度值,計算出各待測樣品對DPPH自由基的清除率K1,即用下式計算:

清除率K1(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai-DPPH溶液和待測溶液吸光度;Aj-待測溶液和溶劑吸光度;A0-DPPH溶液和溶劑的吸光度。

1.2.4.2 OH自由基清除率的測定 參照文獻[14],待測樣品各2 mL,加入6 mmol/L硫酸亞鐵2 ml,再加入6 mmol/L水楊酸-乙醇2 mL,最后加入6 mmol/L的過氧化氫溶液2 mL,搖勻后水浴37 ℃,0.5 h,在510 nm處測定吸光值A1。以等體積水代替水楊酸-乙醇溶液,測定吸光值A2,以扣除樣品本身顏色干擾,以等體積水代替樣品,為空白樣,測定吸光值A0,每份樣品平行測定3次,取平均值。由所測得的吸光度值,計算出各待測樣品對OH自由基的清除率K2,即用下式計算:

清除率K2(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1-樣品+硫酸亞鐵+水楊酸-乙醇+過氧化氫的吸光度;A2-樣品+硫酸亞鐵+蒸餾水+過氧化氫的吸光度的吸光度;A0-蒸餾水+硫酸亞鐵+水楊酸-乙醇+過氧化氫的吸光度。

1.2.4.3 樣品對自由基的半清除濃度(IC50)測定 在最佳工藝條件下,回流提取樣品后,將樣品減壓濃縮,置于真空干燥箱烘干。將樣品配制成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL,以不同濃度的VC為陽性對照，分別測定其對DPPH自由基與OH自由基的清除率,計算其半清除濃度。

1.2.5 體外抗炎活性測試

1.2.5.1 不同濃度樣品對細胞活力影響 根據MTT法[15-16],選取了2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL四個濃度各10 mL,判斷這四個劑量組以及100 ng/mL LPS(脂多糖)處理對巨噬細胞RAW264.7活力影響,設定未加藥(加入DMEM培養基)正常組細胞活力為100%。

1.2.5.2 不同濃度樣品對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中NO含量的影響 利用griess法[17],將密度為2×106個/mL的RAW264.7巨噬細胞，以每孔180 μL均勻接種于96孔板中,細胞貼壁2 h后,每孔分別加入10 μL 2 μg/mL LPS,4 h后加入10 μL 2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL粗提物,設LPS對照和空白對照,每個濃度設4個復孔,培養24 h后取培養液上清于96 孔板中,按50 μL/孔,在各孔中室溫加入Griess試劑Ⅰ和Griess 試劑Ⅱ,標準品用DMEM 稀釋,濃度分別為0.00、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L,以10% DMEM加顯色劑為空白對照,在540 nm酶標儀測定各孔吸光度值,以NaNO2為標準品,按標準曲線回歸方程求出待測樣品中NO濃度。

1.3 數據處理

采用Microsoft excel 2017,Origin Pro 8,SPSS 17.0進行數據處理,單因素試驗和抗氧化、抗炎活性測定均重復3次,取平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溫度對火龍果花提取物抗氧化活性的影響 由圖1可知,提取溫度對DPPH自由基及OH自由基的清除率都有著一定的影響,在溫度為45～75 ℃時,提取液對DPPH自由基和OH自由基清除率隨溫度的上升而增加,但超過75 ℃后,清除率隨溫度的上升而減小,這可能是因為，過高的溫度會使火龍果花中抗氧化活性成分多酚、花青素、多糖等的結構被破壞[18],從而使提取物對DPPH自由基和OH自由基的清除率減小。綜上可知,75 ℃下提取時提取物對自由基的清除能力最強。

圖1 提取溫度對DPPH和OH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of extracting temperature on the DPPH and OH radical-scavenging

2.1.2 料液比對火龍果花提取物抗氧化活性的影響 由圖2可看出,樣品和溶劑在不同的比例下,對DPPH自由基清除率及OH自由基的清除率影響也不同,且在料液比為1∶20～1∶30 g/mL范圍內,清除率隨料液比的增加而上升,這是由于，隨著提取溶液的增多,樣品在溶液中的分散程度增大,提取物與溶劑的接觸面積增大,有利于火龍果花中抗氧化活性成分能充分溶出。但超過1∶30 g/mL后,清除率變化不大,這可能是由于達到一定的料液比時,火龍果花提取液中的抗氧化活性成分多糖、黃酮等基本溶解完全,溶劑量繼續增加,抗氧化活性成也不會再有所增加,考慮到實驗過程中原料的經濟性與實驗的效率,選定料液比在1∶30 g/mL為最佳。

圖2 料液比對DPPH和OH自由基清除率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the DPPH and OH radical scavenging rate

2.1.3 提取時間對火龍果花提取物抗氧化活性的影響 由圖3可知,在熱回流法提取火龍果花體外抗氧化性的實驗中,提取的時間對清除率有影響,且呈這樣一個規律:提取時間1.0～3.0 h時,提取液對DPPH自由基和OH自由基的清除率都呈上升趨勢,而超過3.0 h后,清除率呈下降趨勢,這可能是因為，火龍果花提取液中的抗氧化活性成分在一定時間、溫度下與溶劑充分接觸，基本已經溶解完全,繼續增加時間,反而會使得某些成分被破壞[19]。因此,提取時間設定在3.0 h,提取效果最佳,提取液清除自由基能力最強。

圖3 提取時間對DPPH和OH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of extracting time on the DPPH and OH radical scavenging rate

2.1.4 溶劑濃度對火龍果花提取物抗氧化活性的影響 由圖4可知,提取溶劑的濃度對自由基的清除率影響趨勢是:當乙醇濃度為60%～70%范圍時,清除率呈逐漸上升的趨勢,但當乙醇濃度繼續增加時,提取液最自由基的清除率反而下降,這可能是由于高濃度的乙醇極性偏小,會使火龍果花中的蛋白、多糖等極性稍大的成分凝固而不能溶解,或者一些酚類不能被溶出[20],抗氧化活性成分的溶解度變低,導致提取物與對自由基的清除率能力下降。故設定70%的乙醇濃度為最佳條件。

圖4 乙醇濃度對DPPH和OH自由基清除率的影響Fig.4 Effects of ethanol concentrationon the DPPH and OH radical scavenging rate

2.2 正交實驗結果及驗證

在單因素實驗基礎上,按L9(34)進行正交試驗設計(見表2)。

表2 L9(34)正交試驗設計及結果Table 2 L9(34)orthogonal test design and results

本實驗研究了提取溫度、提取時間、料液比以及乙醇濃度四個因素對火龍果花提取物體外抗氧化活性的影響,由正交實驗的結果中極差分析得,影響火龍果花提取的因素主次順序為D>C>A>B,即乙醇濃度對結果影響最大,其次是料液比,接著是提取溫度,提取時間的影響最小。根據L9(34)正交實驗確定出最佳提取工藝條件為A2B2C2D2,即提取溫度為75 ℃、提取時間為3.0 h、料液比為1∶30 g/mL、溶劑乙醇濃度為70%,在最佳提取工藝下所測得的DPPH自由基清除率達到86.40%±1.07%,OH自由基的清除率達到83.50%±0.52%。

2.3 最佳提取工藝條件下樣品對自由基的半清除濃度(IC50)

在最佳工藝條件下所得樣品,由圖5和圖6可知,樣品與VC對自由基的清除能力隨著樣品濃度的增加而增大,計算其對自由基的半清除濃度。結果表明:樣品對DPPH自由基的清除曲線方程:y=185.17x-0.493,R2=0.9985,IC50值為0.273 mg/mL,VC對DPPH自由基:y=790.62x+17.12,R2=0.9974,IC50值為0.0416 mg/mL;樣品對OH自由基的清除曲線方程:y=178.27x-0.132,R2=0.9974,IC50值為0.288 mg/mL。VC對OH自由基的清除曲線方程:y=140.94x-0.877,R2=0.9986,IC50值為0.361 mg/mL。綜上所述,樣品對DPPH自由基的清除率低于VC,而樣品對OH自由基的清除率高于VC。

圖5 樣品濃度對DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effect of sample concentration on DPPH· radical scavenging ability

圖6 樣品濃度OH自由基的清除能力的影響Fig.6 Effect of sample concentration on OH radical scavenging ability

2.4 最佳提取工藝條件下體外抗炎活性測定結果

2.4.1 不同濃度的樣品對細胞活力的影響 由圖7試驗結果表明,與正常組相比,選取的四個劑量組以及LPS的加入對RAW264.7細胞活力也無顯著差異(p>0.05)。證明在實驗設置的藥物劑量下,設定濃度的樣品沒有細胞毒性。

圖7 粗提物濃度對細胞活力的影響Fig.7 Effect of extract concentration on cell viability注:a表示組間差異不顯著(p>0.05,n=3)。

2.4.2 粗提物對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞中NO的作用 從圖8中可見,相較于正常組,LPS作用后的RAW264.7巨噬細胞中NO含量極顯著增大(p<0.01);相較于LPS組,粗提物可極顯著抑制NO的釋放(p<0.01),且濃度越大,化合物對LPS誘導RAW264.7細胞產生NO的抑制作用越強。表明化合物通過抑制NO的釋放表現出來的抗炎活性與濃度呈正相關,具有劑量依賴性,得抑制率與樣品濃度曲線方程:y=2.502x+15.15,R2=0.980(x為樣品濃度，μg/mL；y對NO的抑制率，%),算得粗提物對NO的半抑制濃度IC50為13.94 μg/mL。

圖8 粗提物濃度對細胞中NO的影響Fig.8 Effect extract concentration on NO in cell 注:不同大寫字母表示組間差異極顯著(p<0.01,n=3)。

3 結論

本實驗對火龍果花粗提物體外抗氧化活性工藝及抗炎進行了初步探究。實驗結果表明:在70%乙醇,1∶30 g/mL料液比,提取溫度75 ℃,3.0 h熱回流為最佳提取條件,此條件下粗提物對DPPH自由基的IC50值為0.273 mg/mL,OH自由基的IC50值為0.288 mg/mL。最佳工藝條件下提取物對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞產生的NO有很強的抑制作用,且與濃度呈正相關,具有劑量依賴性,其半抑制濃度IC50值為13.94 μg/mL,可見火龍果花具有較好的體外抗氧化和抗炎活性。有關資料顯示火龍果花中含有豐富的多糖、黃酮和黃酮醇、三萜類化合物等活性物質[2,21],這些物質涉及抗氧化[11]、抗炎[22]等功效與本研究結果一致。該研究為拓寬火龍果花綜合利用途徑奠定基礎和提供理論依據，為火龍果花的藥用成分的進一步研究提供了一定的實驗依據,為火龍果花資源的開發利用打下基礎。