六堡茶茶褐素的提取工藝優化及其理化性質

周 婷,黃文權,謝加仕,張均偉,龔受基,4,*

(1.桂林醫學院藥學院,廣西桂林 541004;2.欽州學院食品工程學院,廣西欽州 535011;3.梧州中茶茶業有限公司,廣西梧州543000;4.廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室(欽州學院)，廣西欽州 535011)

六堡茶屬于黑茶,產于廣西梧州六堡鄉,歷史悠久,其色澤黑褐光潤,湯色紅濃明亮,滋味醇和,香氣醇陳,以“紅、濃、陳、醇”四絕著稱,具有清熱利濕、分解油膩、降糖養神的功效。由于其獨特的保健特性,六堡茶產品逐漸被消費者認可,擁有的市場份額增加,尤其在傳統市場東南亞國家的知名度不斷攀升。基于其市場價值和科研理論價值,六堡茶也漸漸進入了科學工作者的視野。六堡茶經過窖藏,茶葉中的其他多酚類物質發生氧化成分大幅下降,茶褐素卻顯著增加,顯示出黑茶的獨特品性。茶褐素是一種水溶性色素,被稱為“黑茶中的黃金”,在改善糖脂代謝、防治糖尿病、減肥降脂、預防心血管疾病等方面效果顯著,對改善人體的綜合代謝平衡有著很大的幫助[1-3]。

普洱茶茶褐素的研究比較深入,主要集中在提取工藝、理化分析和功效等方面[4-5]。六堡茶茶褐素相關研究相對較少,在提取方法及工藝方面僅見大孔樹脂純化[6]及正交試驗法的應用[3]。何英姿[3]等采用正交試驗法對六堡茶茶褐素的提取工藝進行了優化,優化后的工藝為料液比1∶30,提取溫度100 ℃、時間80 min。響應面分析法是一種實驗條件尋優的方法,近年來在藥物提取和處方工藝的優化方面應用較多,本實驗應用該方法優化六堡茶茶褐素的提取工藝,比正交試驗法更簡化,更精確,其試驗次數也較少[7],具有操作簡單、精度高、預測性好等優點[8-9],并適用于多因素、多水平的試驗。利用溶劑提取法對六堡茶茶褐素進行提取研究,并對茶褐素理化性能進行分析,以期闡明其化學組成及特征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六堡茶 梧州中茶茶業有限公司;考馬斯亮蘭G250、牛血清白蛋白(100 g,≥98%) 合肥博美生物科技有限責任公司;其他試劑 均為國產分析純。

XS205電子分析天平 瑞士METTLER公司;80-臺式離心機 上海精密儀器儀表有限公司;Epoch酶標儀 美國Bio-tek;RE-52AA旋轉蒸發儀 鄭州長城科工貿有限公司;SHB-IIIA循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;UV-1800紫外可見光分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 六堡茶茶褐素的提取 準確稱取5 g茶樣,裝入錐形瓶中,并加入蒸餾水,按照茶葉∶蒸餾水=1∶15～1∶55的料液比,將溶液加熱到溫度60～100 ℃,浸提40～120 min,溶液趁熱抽濾(浸提中搖瓶2～5次),濾液減壓濃縮至濾液的1/5～1/10,將上述濃縮液依次用2倍體積的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取2、3、4次,將水層溶液倒入錐形瓶,添加無水乙醇使乙醇體積分數為80%[10],低溫靜置12 h后，在4500 r/min的條件下離心10 min,收集離心所得沉淀。以50 mL蒸餾水溶解離心管中的沉淀,充分溶解后，吸取溶液3 mL于25 mL容量瓶中,用蒸餾水定容。

1.2.2 單因素實驗設計 將料液比、提取溫度、提取時間作為單因素實驗考察的主要因素,分別研究3個因素對茶褐素提取得率的影響。先固定料液比為1∶35 g/mL,提取時間為60 min,提取次數1次,提取溫度分別取60、70、80、90、100 ℃;在確定提取溫度為90 ℃的前提下,固定提取時間為60 min,提取次數1次,料液比分別取1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55 g/mL;在確定料液比為1∶35 g/mL、提取溫度為90 ℃較合適的前提下,提取次數為1次,分別設定提取時間為40、60、80、100、120 min。

1.2.3 Box-Behnken響應面分析法 在進行單因素實驗的前提下,分別選取料液比、提取溫度、提取時間作為主要影響因素,考察其對六堡茶茶褐素提取得率的影響。將提取得率作為因變量,建立三因素三水平的Box-Behnken響應面法,采用實驗設計軟件Design-Expert8.0.6進行數據處理,確定最佳提取工藝條件。

表1 Box-Behnken設計的因素與水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken design

1.2.4 六堡茶茶褐素對照品的制備 參考文獻[10],稱取10 g茶葉樣品,裝進索氏提取器,加100 mL 95%的乙醇提取,直至乙醇液顏色無色。茶渣用10倍量蒸餾水于燒瓶中提取3次,每次1 h,過濾并合并水提液,減壓濃縮至20～30 mL,依次用2倍體積的三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取2、3、4次,每次振蕩混合時間為3分鐘,靜置分層后放出水層待用。所得水相萃取液于55 ℃,真空度-0.09～-0.10條件下減壓濃縮至20～30 mL左右。加無水乙醇至體積分數為80%,低溫靜置12 h,抽濾收集沉淀,得到該沉淀即為茶褐素對照品,沉淀在60 ℃條件下烘干待用。

取以上制備的茶褐素0.3 g,以100 mL蒸餾水充分攪拌,使其全部溶解。配制質量濃度為 0.18、0.24、0.30、0.48、0.6 mg/mL的茶褐素對照品溶液,蒸餾水為空白,精確吸取150 μL溶液注入96孔板,用酶標儀于270 nm波長下測定吸光值,每次做3個平行。以質量濃度(mg/mL)為橫坐標、以吸光值為縱坐標進行線性分析,方程為Y=0.8451X+0.1408,相關系數R2=0.9995,質量濃度在 0.18～0.60 mg/mL范圍內與吸光值間呈良好的線性關系。

1.2.5 茶褐素提取得率的測定 用酶標儀在270 nm下,蒸餾水為空白,以上述制備茶褐素對照品做標準[10],精確吸取150 μL溶液注入96孔板,測定溶液的吸光度,每次做3個平行,計算茶褐素提取得率。

式中,A為270 nm下測定的吸光值;n為稀釋倍數;m為樣品質量(g)。

1.2.6 六堡茶茶褐素理化成分分析 pH測定采用pH計法[11],取茶褐素樣品配制成質量分數分別為0.1%、1%、5%的溶液,用pH計測定;總酸性基測定參照文獻[5]操作;蛋白質測定采用考馬斯亮藍法[12-13];茶多糖測定采用蒽酮-硫酸法[14]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對六堡茶茶褐素提取得率的影響 不同料液比對六堡茶茶褐素提取得率的影響如圖1,料液比在1∶15～1∶35 g/mL時,提取得率呈上升趨勢,而料液比在1∶35～1∶55 g/mL時，茶褐素提取得率下降。這是因為，隨著溶劑的增多,茶葉與溶劑之間能充分接觸,有利于茶褐素的溶出;當料液比增加到1∶35 g/mL時,茶褐素充分溶出,繼續增加溶劑比例后,茶褐素的溶出受茶葉中其他成分的抑制反而不利于提取[15],考慮到過多提取溶劑的添加會增加濃縮的工作量,過少又會使茶褐素提取不完全而導致原料浪費,所以將料液比定為1∶35 g/mL比較合適。

圖1 料液比對茶褐素提取得率的影響Fig.1 The effect of material-to-liquid ratio on yield of theabrownin

2.1.2 提取溫度對六堡茶茶褐素提取得率的影響 溫度對六堡茶茶褐素提取得率的影響如圖2,提取溫度在60～90 ℃時,隨著提取溫度的升高,茶褐素的提取得率明顯增加;提取溫度為90 ℃時，提取得率達到最高；超過90 ℃時,隨著溫度的升高,茶褐素提取得率呈下降趨勢。考慮到升高溫度,可能會破壞茶褐素的結構,影響其生物活性,故采用提取溫度為90 ℃。

圖2 提取溫度對茶褐素提取得率的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on yield of theabrownin

2.1.3 提取時間對六堡茶茶褐素提取得率的影響 提取時間對六堡茶茶褐素提取得率的影響如圖3,提取時間的增加對提高六堡茶茶褐素提取得率的效果較為明顯,在40～80 min范圍內,隨著提取時間的延長,茶褐素提取得率增加,提取時間超過80 min后,茶褐素提取得率基本恒定。考慮到提取時間延長,除茶褐素外的其他成分也會溶出,而且能耗增加,成本提高,故將提取時間定為80 min比較合適。

圖3 提取時間對茶褐素提取得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on yield of theabrownin

2.2 響應面法對茶褐素提取工藝的分析

根據Box-Behnken試驗設計原理,在單因素試驗基礎上,選取料液比、溫度、時間3個因素的合適水平,對提取工藝進行響應面分析,設計方案及結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken design

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

固定一個變量于“0”水平,作另外2個變量與提取得率的響應面圖見圖4。由3組曲面響應面圖比較結果可知，提取溫度與提取時間的響應曲面圖表現為最陡峭的曲面,因此這兩個因素交互作用對茶褐素提取得率的影響最為顯著;料液比與提取溫度的響應曲面圖表現為較陡峭的曲面,對茶褐素提取得率的影響較為顯著;料液比與提取時間的響應曲面圖表現為較平滑的曲面,對茶褐素提取得率的影響最小。通過Design-Expert 8.0.6實驗軟件分析,最優提取方案為:料液比1∶37.32 g/mL,提取溫度95.89 ℃,提取時間85.67 min;理論預測值茶褐素提取得率為10.38%。為便利實際操作,將上述條件修正為:料液比1∶37 g/mL,提取溫度96 ℃,提取時間86 min。

圖4 各因素的交互作用對提取得率的響應面圖Fig.4 Response surface plots of interaction of various factors on the yield of the abrownine

2.3 驗證實驗

為了驗證響應面法優化六堡茶茶褐素提取工藝的有效性,在優化的提取條件下重復3次試驗,以期考察實驗結果與預測結果的吻合程度,實驗結果表明茶褐素提取得率為10.33%±0.04%,而預測提取得率為10.38%,兩者基本一致,說明回歸方程與實際情況擬合很好,在茶褐素的提取工藝上具有一定的指導意義。采用溶劑提取法得到六堡茶褐素的提取得率為10.33%±0.04%,與文獻[16]相比略高。六堡茶水溶性茶褐素易與蛋白質、茶多糖等高分子物質結合形成復合物,其含量高低可能取決于原料、工藝、陳化時間、提取工藝等因素,所以導致多個研究結果存在差異[5,16-18]。

2.4 六堡茶水溶性茶褐素的理化成分分析

六堡茶水溶性茶褐素中富含羧基、甲基、羥基、氨基,其酸堿性取決于酸堿基團的數目、電離常數。質量分數為5%、1%、0.1%的茶褐素溶液pH稍有差異,且濃度越小,pH越接近中性,濃度變稀,一方面電離常數變大使氫離子濃度有增大趨勢,另一方面酸性基團數目減少使氫離子濃度有減少趨勢,在這過程中可能酸性基團數目減少占優勢,導致pH隨茶褐素濃度減少而升高,但總體上茶褐素呈弱酸性,與文獻[19]記載一致。茶褐素中總酸性基為(5.5±0.02) mmol·g-1,其中羧基(1.34±0.05) mmol·g-1,酚羥基(4.16±0.04) mmol·g-1,主要以酚羥基為主,占75.6%,六堡茶水溶性茶褐素的酸性貢獻主要來源于酚羥基,結果與秦誼等[11]報道的一致。

表4 濃度與pH關系Table 4 Relationship of concentration and pH

表5 成分測定結果Table 5 Determination results of constituents

采用考馬斯亮藍法,以牛血清白蛋白做標準曲線,回歸方程為Y=47.143X-0.5889(R2=0.9997),其中X為牛血清白蛋白含量,Y為溶液吸光度,測得六堡茶茶褐素中蛋白質的含量為(15.45±0.06)%,與文獻相近[19]。

茶多糖的測定以麥芽糖為標準,回歸方程為:Y=0.0714X+18.403(R2=0.9994),其中X為麥芽糖含量,Y為溶液吸光度,測得多糖含量為(25.16±0.11)%。茶多糖在茶褐素中比重較大,超過20%,其不但是茶湯呈甜味的主要物質基礎[20],而且可能是生理活性的作用位點。

3 結論與討論

在單因素考察結果的基礎上，進行了響應面法研究,六堡茶茶褐素最佳提取方案為料液比1∶37 g/mL,提取溫度96 ℃,提取時間86 min,理論預測茶褐素提取得率為10.38%,實際實驗值為10.33%±0.04%。影響六堡茶茶褐素提取得率的各因素影響大小排列次序依次為提取溫度>提取時間>料液比。

茶褐素提取得率除與廠家、原料、加工工藝、陳化時間、主觀因素和測定方法等不同外,采用黃意歡的系統分析法測定數據時,六堡茶的茶褐素從19.31%～38.16%不等[21-22],普洱茶的茶褐素含量從7.23%～12.76%[23],雅安藏茶中茶褐素含量從3.20%～14.86%不等[24-25]。利用該測定方法測定30個典型普洱茶樣品茶褐素含量,茶褐素含量范圍在5.28%～9.73%之間,相對傳統方法測定值7.36%～11.81%略低[10]。本文測定六堡茶茶褐素采用上述方法,茶褐素提取得率為10.33%±0.04%,與傳統方法測定的茶褐素含量相近,而與該法測定的普洱茶茶褐素值略高,從理論和趨勢上與上述文獻吻合。利用響應面分析法對六堡茶茶褐素的提取進行研究,并對茶褐素的理化性能進行分析,發現其與普洱茶比較略有差異,六堡茶水溶性茶褐素的酚羥基占75.6%,普洱茶中酚羥基占88%,其三種濃度的平均pH為6.29,比六堡茶pH5.93略大[19],其原因可能與加工原料和加工工藝有關,導致其物質轉化出現差異[26],但兩者都具有黑茶的共同特征。