響應(yīng)面法優(yōu)化芡莖多糖脫蛋白工藝

王 倩,吳啟南,2,*,許一鳴,戴仕林,喬晶晶,薛 敏,黃曉燕

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023;2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023)

芡(EuryaleferoxSalisb)為睡蓮科單屬種水生植物,有蘇芡和刺芡兩個(gè)品種[1]。芡莖是芡的葉柄和花梗，又稱雞頭菜,嫩莖在夏秋季節(jié)常作為時(shí)令蔬菜食用[2]。據(jù)《本草綱目》記載,芡莖有“止煩渴,除虛熱”之功效[3]。

芡莖中氨基酸和膳食纖維等為多糖的獲得提供了豐富的原材料[4]。目前多糖的藥理作用有免疫調(diào)節(jié)[5-6]、抗腫瘤[7-8]、降血糖[9]、抗氧化[10-11]、抗疲勞[12]等。多糖的藥理活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān),從植物中提取的多糖常與蛋白形成糖蛋白復(fù)合物,這往往會(huì)直接或間接影響其藥理活性。故研究植物多糖一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是去除多糖中的蛋白質(zhì)。根據(jù)以往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),物理法、化學(xué)法、生物法是目前多糖脫蛋白最常用的方法[13]。其中物理方法常見的有反復(fù)凍融法[14],生物法常見的有蛋白酶法,化學(xué)法研究較多的有Sevag法[15]、TCA法[16-17]等。TCA法脫蛋白時(shí)多糖損失一般較大,而Sevag法需要反復(fù)多次且會(huì)導(dǎo)致部分多糖水解,故現(xiàn)在多有將化學(xué)方法與酶法相結(jié)合[18]。因此,本實(shí)驗(yàn)以芡莖多糖為研究對(duì)象,主要對(duì)比研究芡莖粗多糖不同脫蛋白方法,以期從這些方法中找到一個(gè)最適合芡莖多糖脫蛋白的方法,并對(duì)優(yōu)選出的方法進(jìn)行工藝優(yōu)化,為后續(xù)的藥理藥效以及食品、化妝品的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芡莖 采集于高郵界首,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為睡蓮科芡屬(EuryaleferoxSalisb.)芡的葉柄和花梗;牛血清蛋白 美國(guó)Sigma公司;木瓜蛋白酶 800 U·mg-1,上海源葉生物有限公司;葡萄糖 上海阿拉丁生物化學(xué)科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)G250、蒽酮、正丁醇、三氯乙酸 分析純,南京建成;濃硫酸、三氯甲烷 分析純,溧陽市東方化學(xué)試劑有限公司。

KH-300SP型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;AUW220D百萬分之一電子天平 日本島津公司;UV-1100型紫外分光光度計(jì) 南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司;SAGA-10TY實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水儀 南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芡莖多糖制備 原料預(yù)處理:將芡莖切3～5 cm小段,50 ℃烘干,粉碎過20目篩。稱取500 g芡莖粉末,加10倍量無水乙醇,回流提取三次,每次2 h,抽濾,棄濾液,濾渣揮干溶劑,以除去芡莖中的有色物質(zhì)、小分子多糖、低聚糖及小分子化合物,得到預(yù)處理的芡莖粉末備用[19]。

多糖提取:稱取預(yù)處理的芡莖粉末按液料比40∶1加入超純水,超聲提取(40 kHz,80 ℃)32 min,抽濾,濾液加無水乙醇使得含醇量為80%,4 ℃過夜,離心(3000 r·min-1,10 min),棄濾液,無水乙醇洗3次,冷凍干燥,得芡莖粗多糖[19]。

1.2.2 脫蛋白方法

1.2.2.1 Sevag法 參考張帥、王世佳、吳春[20-22]等方法,取10 mg·mL-1芡莖多糖溶液,加入1/5體積Sevag試劑[氯仿∶正丁醇=5∶1 (v/v)],搖床劇烈振搖20 min后,3000 r·min-1離心10 min,去除分界層以下部分,重復(fù)5次,取上清液測(cè)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率。

1.2.2.2 三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)法 參考林翔凱[23]的方法,取6個(gè)錐形瓶,分別加入10 mL 5 mg·mL-1芡莖多糖溶液,再加入10 mL體積分?jǐn)?shù)分別為0、2%、4%、6%、8%、10%三氯乙酸溶液,振搖20 min,4 ℃過夜,離心(3000 r·min-1,10 min)除去沉淀,取上清液測(cè)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率。

1.2.2.3 木瓜蛋白酶法 參考楊斌[24]的方法,取10 mg·mL-1芡莖粗多糖溶液25 mL,加入0.1 mL木瓜蛋白酶(1 g·L-1)溫度55 ℃，時(shí)間2.5 h進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10 min滅活,冷卻至室溫,3000 r·min-1離心10 min,取上清液測(cè)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率。

1.2.2.4 木瓜蛋白酶-TCA法 參考何沂飛、徐丹鴻、劉小攀[25-27]等方法,取10 mg·mL-1芡莖多糖溶液25 mL,加入0.1 mL木瓜蛋白酶液(1 g·L-1)，溫度55 ℃，酶解2.5 h進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10 min滅活,冷卻,3000 r·min-1離心10 min,除去沉淀,取上清液。上清液再加入等體積的2.0% TCA溶液,振搖20 min,4 ℃過夜,離心(3000 r·min-1,10 min)除去沉淀,取上清液測(cè)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率。

1.2.3 木瓜蛋白酶法脫蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響 取芡莖多糖溶液25 mL,分別加入濃度為160、320、480、640、800 U·mL-1的木瓜蛋白酶液1 mL,調(diào)節(jié)酶解時(shí)間為1 h,酶解溫度為60 ℃,pH7,反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅活10 min,冷卻至室溫,3000 r·min-1離心10 min,除去沉淀,取上清液測(cè)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率。

1.2.3.2 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響 取芡莖多糖溶液25 mL,加入濃度為480 U·mL-1木瓜蛋白酶液1 mL,調(diào)節(jié)酶解時(shí)間為1 h,pH7,酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅活10 min,冷卻至室溫,3000 r·min-1離心10 min,除去沉淀,取上清液測(cè)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率。

1.2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響 取芡莖多糖溶液25 mL,加入濃度為480 U·mL-1木瓜蛋白酶液1 mL,調(diào)節(jié)酶解溫度為40 ℃,pH7,酶解時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅活10 min,冷卻至室溫,3000 r·min-1離心10 min,除去沉淀,取上清液測(cè)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶法脫蛋白 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,按照中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[32],選取加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)為主要因素,以蛋白脫除率和多糖損失率為指標(biāo),進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),見表1。

表1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平與編碼Table 1 Independent variables and levels of the response surface design

1.2.5 蛋白質(zhì)及多糖含量測(cè)定

1.2.5.1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液:精密稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg,加入95%乙醇50 mL,再加入85%磷酸100 mL,最終用超純水定容至1000 mL,置于棕色瓶中備用。

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線:精密稱取結(jié)晶牛血清白蛋白10.000 mg,加水溶解并定容至100 mL,即得100 μg·mL-1的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL用去離子水配成0、20、40、60、80、100 μg·mL-1的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液,分別取上述溶液各1 mL于10 mL離心管,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,密塞,搖勻,靜置5 min于595 nm測(cè)定吸光度[29-30]。

1.2.5.2 多糖含量測(cè)定 蒽酮硫酸溶液:精密稱取蒽酮0.050 g,加入80%濃硫酸50 mL,置于50 mL燒杯中,得1 mg·mL-1的蒽酮硫酸溶液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.025 g,于250 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并稀釋至刻度得100 μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL用去離子水配成0、20、40、60、80、100、120、140 μg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,分別取上述溶液各2 mL于10 mL離心管,加入6 mL蒽酮硫酸溶液,密塞,搖勻,冰浴,待全部加完,沸水浴15 min,冰水浴15 min,取出搖勻于620 nm測(cè)定吸光度[31-32]。

按照下式計(jì)算蛋白脫除率和多糖損失率

式(1)

式(2)

式中:Ri為粗多糖中蛋白含量(μg);Rj為脫蛋白處理后樣品中蛋白含量(μg);Ti為粗多糖中多糖含量(μg);Tj為脫蛋白處理后樣品中多糖含量(μg)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)及多糖含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照“1.2.5.1”方法得到牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),吸光度為縱坐標(biāo)(Y)之間的回歸方程為Y=0.0054X-0.0045(R2=0.9992),線性范圍為0～100 μg·mL-1。按照“1.2.5.2”方法得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),吸光度為縱坐標(biāo)(Y)之間的回歸方程為 Y=0.0045X+0.0002(R2=0.9996),線性范圍為0～140 μg·mL-1。

圖1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin determination by coomassie brilliant blue method

圖2 蒽酮硫酸法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose determination by anthrone-sulfuric acid method

2.2 四種脫蛋白方法比較

2.2.1 Sevag法脫蛋白 Sevag法脫蛋白是利用有機(jī)溶劑使溶液中蛋白質(zhì)變性沉淀而清除蛋白質(zhì)的原理。由圖3可知，隨著脫蛋白次數(shù)的增加蛋白脫除率變化不顯著，而多糖損失率(前3次)卻隨著脫蛋白次數(shù)的增加而顯著(p<0.05)增加，第4、5次隨著脫蛋白次數(shù)的增加變化不顯著，綜合考慮選取第5次脫蛋白結(jié)果與其他三種方法進(jìn)行比較。

圖3 Sevag法脫蛋白效果Fig.3 The effect of removal with the sevag method注:圖中字母不同為差異顯著,p<0.05,圖4～圖7同。

2.2.2 TCA法脫蛋白 TCA作為一種有機(jī)酸能使蛋白質(zhì)帶正電荷并與負(fù)離子結(jié)合成不溶性鹽。由圖4可知,隨著TCA體積分?jǐn)?shù)的增加,蛋白脫除率顯著增加(p<0.05),說明脫蛋白效率在不斷提高,但同時(shí)多糖損失率也高達(dá)50.0%以上。故TCA法除蛋白有利有弊,雖然除蛋白效率高,但對(duì)多糖的影響較為嚴(yán)重,綜合考慮,利用體積分?jǐn)?shù)8.0%的TCA法脫蛋白的效果較Sevag法好。

圖4 TCA法脫蛋白效果Fig.4 The effect of removal with the TCA

將四種脫蛋白方法進(jìn)行綜合比較,由表2可知,從蛋白脫除率來看,木瓜蛋白酶-TCA法極顯著(p<0.01)優(yōu)于單一的木瓜蛋白酶法和Sevag法,顯著(p<0.05)劣于單一TCA法;再分析其多糖損失率,木瓜蛋白酶-TCA法顯著(p<0.05)優(yōu)于其他三種方法,綜合考慮蛋白脫除率和多糖損失率木瓜蛋白酶-TCA法不僅脫蛋白效果好且多糖損失少,因此,確定利用木瓜蛋白酶-TCA法對(duì)芡莖多糖進(jìn)行脫蛋白處理,該法既可較大程度地脫除雜質(zhì)蛋白又能保證最小程度損失多糖,所以針對(duì)木瓜蛋白酶-TCA法進(jìn)一步設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化木瓜蛋白酶法脫蛋白工藝,并將優(yōu)化出的木瓜蛋白酶法脫蛋白最優(yōu)工藝與TCA法最佳工藝結(jié)合處理一次,以確定木瓜蛋白酶-TCA法最佳的脫蛋白工藝條件。

表2 四種脫蛋白方法效果比較Table 2 The comparison of deproteinization effect of four

2.3 木瓜蛋白酶法脫蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響 由圖5可知,其蛋白脫除率呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì),加酶量為480 U·mL-1時(shí),蛋白脫除率達(dá)到最大值此時(shí)多糖損失也最少,故綜合考慮二者,選取加酶量為480 U·mL-1為宜。

圖5 加酶量對(duì)蛋白脫除率和多糖損失率的影響Fig.5 Effect of enzyme concentration on the rate of protein-removed and polysaccharide losing rate

2.3.2 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響 由圖6可知,蛋白脫除率先增加后下降且在40 ℃時(shí)達(dá)到一個(gè)峰值,這是因?yàn)闇囟冗^高會(huì)破壞酶的活性;其多糖損失率也在40 ℃損失最少,表明40 ℃可能是其適宜的酶解溫度。

圖6 酶解溫度對(duì)蛋白脫除率和多糖損失率的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on the rate of protein-removed and polysaccharide losing rate

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響 由圖7可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白脫除率先增加后減少且在1.5 h時(shí)取得最大值,可能的原因是隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)酶與底物特異性結(jié)合趨于飽和以及長(zhǎng)時(shí)間酶解破壞了酶該有的活性。多糖損失率則隨著時(shí)間的延長(zhǎng)變化不顯著,故綜合二者來看,選取酶解時(shí)間1.5 h作為適宜的酶解時(shí)間。

圖7 酶解時(shí)間對(duì)蛋白脫除率和多糖損失率的影響Fig.7 Effect of hydrolysis time on the rate of protein-removed and polysaccharide losing rate

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

采用Box-behnken實(shí)驗(yàn)方案,對(duì)木瓜蛋白酶法脫蛋白的條件進(jìn)行優(yōu)化,響應(yīng)面分析結(jié)果見表3。以蛋白脫除率和多糖損失率為響應(yīng)值，各因素經(jīng)回歸擬合后得到的回歸方程分別為:

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 The Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

蛋白脫除率Y1(%)=54.17+1.10A-2.22B+0.87C+0.52AB+1.05AC-1.87BC+2.35A2-1.21B2+1.99C2

多糖損失率Y2(%)=29.92-1.51A+4.56B+1.82C+2.60AB+0.54AC+2.15BC+7.14A2-0.16B2+0.96C2

表4方差分析表明,該模型回歸極顯著(p<0.01),失擬項(xiàng)(p=0.0983>0.05)不顯著,表明二次多項(xiàng)式回歸模型可靠;R2=0.9940,表明響應(yīng)值蛋白脫除率的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度,因此該模型可用于預(yù)測(cè)響應(yīng)值的實(shí)際情況。F值可以反映出各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的重要性,各因素的貢獻(xiàn)率為:B>A>C,即酶解溫度>加酶量>酶解時(shí)間。

表4 蛋白脫除率回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Protein removal rate of the regression model of variance analysis results

對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn),得到模型一次項(xiàng)A、B、C,二次項(xiàng)A2、B2、C2及交互作用項(xiàng)AB、AC、BC差異顯著(p<0.05),表明加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間以及加酶量與酶解溫度、加酶量與酶解時(shí)間、酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)芡莖多糖蛋白脫除率有顯著影響,由圖8可以直觀地看出各因素交互作用對(duì)芡莖多糖蛋白損失率的影響,若曲線越陡峭,表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)矫舾?該因素的交互作用對(duì)蛋白損失的影響越大;反之曲面坡度越平緩,操作條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小。從圖8可知酶解溫度與酶解時(shí)間交互作用的影響最大,加酶量與酶解時(shí)間以及加酶量與酶解溫度交互作用的影響次之。表4回歸分析結(jié)果也與此相吻合。

圖8 各因素交互作用對(duì)蛋白脫除率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Three-dimensional response surface diagram showing interactive effects of different factors on the rate of protein-removed rate

表5方差分析表明,該模型回歸極顯著(p<0.01),失擬項(xiàng)(p=0.0838>0.05)不顯著,表明二次多項(xiàng)式回歸模型正確;R2=0.9610,表明響應(yīng)值多糖損失率的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度,因此該模型可用于預(yù)測(cè)響應(yīng)值的實(shí)際情況。F值可以反映出各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的重要性,由表5可知,各因素的貢獻(xiàn)率為:B>C>A,即酶解溫度>酶解時(shí)間>加酶量。

表5 多糖損失率回歸模型方差分析結(jié)果Table 5 Polysaccharide loss rate of the regression model of variance analysis results

對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn),得到模型一次項(xiàng)A、B、C,二次項(xiàng)A2及交互作用項(xiàng)AB、BC差異顯著(p<0.05),表明加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間以及加酶量與酶解溫度、酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)多糖損失率有顯著影響,且各具體實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由圖9可以直觀地看出各因素交互作用對(duì)芡莖多糖損失率的影響,若曲線越陡峭,表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)矫舾?該因素的交互作用對(duì)芡莖多糖損失的影響越大;反之曲面坡度越平緩,操作條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小。從圖9可知加酶量和酶解溫度的交互作用影響較大,加酶量和酶解時(shí)間以及酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用影響次之。表5回歸分析結(jié)果也與此相吻合。

圖9 各因素交互作用對(duì)多糖損失率影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Three-dimensional response surface diagram showing interactive effects of different factors on polysaccharide losing rate

2.5 最佳條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Design-Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得到芡莖多糖木瓜蛋白酶法脫蛋白的最佳工藝條件為加酶量為578.26 U·mL-1、酶解溫度30.34 ℃、酶解時(shí)間為1.99 h,此條件下由回歸方程計(jì)算出的芡莖多糖蛋白脫除率和多糖損失率理論值分別為61.7%、26.6%。考慮實(shí)際可操作性,將最佳工藝參數(shù)修正為加酶量為580 U·mL-1、酶解溫度30 ℃、酶解時(shí)間為2.0 h,此條件下進(jìn)行蛋白脫除率和多糖損失率的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn),實(shí)際蛋白脫除率和多糖損失率平均值分別為62.1%和25.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好,說明該模型能較好預(yù)測(cè)芡莖多糖脫蛋白工藝。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化最優(yōu)條件結(jié)合TCA法

將利用響應(yīng)面優(yōu)化且修正后的工藝參數(shù)即加酶量為580 U·mL-1、酶解溫度30 ℃、酶解時(shí)間為2.0 h結(jié)合TCA法優(yōu)化出最佳體積分?jǐn)?shù)8.0%處理一次，經(jīng)三次平行實(shí)驗(yàn)，蛋白脫除率和多糖損失率平均值分別為85.1%、16.3%。

3 結(jié)論

本研究通過不同脫蛋白方法的比較，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶結(jié)合TCA法的蛋白脫除效果優(yōu)于其他3種方法，這可能與兩者脫蛋白原理和性質(zhì)有關(guān)。TCA法是經(jīng)典的蛋白脫除法，其原理是化學(xué)試劑使蛋白質(zhì)變性沉淀而被去除，與常見的Sevag法相比，TCA法蛋白脫除效果更優(yōu)，另外從生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)者安全角度考慮，TCA法無需用到氯仿這種有毒試劑，更加安全。酶法條件溫和、有機(jī)試劑污染少，操作方便，在促進(jìn)蛋白質(zhì)水解的同時(shí)，多糖損失較少，故采用木瓜蛋白酶法和TCA法結(jié)合應(yīng)用脫蛋白是一種較優(yōu)的芡莖多糖脫蛋白方法。