普洱茶茶渣中茶多糖的超聲波輔助提取及其抗氧化性

丁世環(huán),張嘉楊,魯群岷

(重慶能源職業(yè)學(xué)院,重慶 402260)

隨著我國茶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展,我國茶葉深加工產(chǎn)品的產(chǎn)量也與日遞增,茶飲料已成為飲料市場當(dāng)中,產(chǎn)銷量僅次于飲用水和碳酸飲料的第三位產(chǎn)品[1]。中國茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告(2017),截止2016年全國普洱茶飲料產(chǎn)值已突破70億元,產(chǎn)量也將突破300萬噸[2]。在產(chǎn)量和產(chǎn)值均實(shí)現(xiàn)快速增長的同時(shí),生產(chǎn)普洱茶飲料所遺留的大量茶渣也帶來了生產(chǎn)環(huán)保問題。雖然部分有一定環(huán)保技術(shù)能力的公司能夠有效的對(duì)這些茶渣進(jìn)行處理,但是大部分公司在處理這些茶渣時(shí),并未將其作為環(huán)保垃圾進(jìn)行專業(yè)化處理,而是將其作為普通垃圾隨意丟棄,這就可能會(huì)在一定程度上影響區(qū)域內(nèi)的環(huán)保安全[3]。因此,進(jìn)一步開發(fā)利用普洱茶茶渣,使之成變廢為寶,可以有效地解決普洱茶茶渣所帶來的環(huán)保問題。

茶多糖(Tea Polysaccharide),作為茶葉中的多糖類復(fù)合物,是目前茶葉生化成分當(dāng)中僅次于茶多酚的功能性物質(zhì)[4]。研究證明,茶多糖具有降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、防輻射、防動(dòng)脈稠狀硬化、增強(qiáng)人體免疫力等多重功效[5]。鑒于茶多糖良好的人體保健價(jià)值,如何高效對(duì)其進(jìn)行提取、分離、純化已成為國內(nèi)茶葉保健食品行業(yè)研究的重要方向[6]。

目前,茶多糖實(shí)驗(yàn)室提取的方法主要包括醇沉法、水浸提法,活性酶輔助浸提法、微波輔助浸提法以及超聲波輔助浸提法[7]。已有文獻(xiàn)證明,采用超聲波技術(shù)來輔助茶葉中茶多糖的提取具有成本低、功效保持性良好、提取效率高的優(yōu)勢[8]。因此,本研究將以醇沉法為基礎(chǔ),進(jìn)一步分析超聲波輔助提取過程中的可調(diào)控試驗(yàn)因素對(duì)普洱茶茶渣中茶多糖得率的影響,并篩選確定普洱茶茶渣中茶多糖超聲波輔助提取最優(yōu)的工藝參數(shù)。同時(shí),對(duì)提取的茶多糖進(jìn)行抗氧化性研究,以期為拓展普洱茶茶渣中茶多糖的利用途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱茶茶渣 四川富正源生物科技有限公司提供;蒽酮、濃硫酸、95%乙醇、H2O2、水楊酸、無水乙醇、丙酮、無水乙醚,硫酸亞鐵、鄰三苯酚 均為分析純;

KQ-800KDV型臺(tái)式高功率數(shù)控超聲波清洗器 江蘇同君儀器科技有限公司;UV1300型紫外可見分光光度計(jì) 成都信立邦生物制藥有限公司;5810R型臺(tái)式高速大容量離心機(jī) 德國Eppendorf艾本德股份公司;YRE-2050A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海瑪尼儀器設(shè)備有限公司;FD-1A-50小型臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī) 上海利聞科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶多糖的制備工藝 普洱茶茶渣預(yù)處理:稱取一定質(zhì)量的普洱茶茶渣,粉碎并過40目篩,依次加入等比例的乙醇和無水乙醚進(jìn)行脫脂處理。以乙醇為溶液,按照一定浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比、超聲功率浸提預(yù)處理后的普洱茶茶渣,經(jīng)過高速離心(4000 r/min,15 min)沉淀后,采用真空抽濾的方式除去殘留物,濾液在90 ℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮[9];采用濃度為80%的乙醇溶液進(jìn)行醇沉,醇沉溫度為30 ℃,時(shí)間為1 h[10];醇沉產(chǎn)物按照4000 r/min的速度離心處理15 min[11],去除上清液,依次采用無水乙醇、丙酮、無水乙醚進(jìn)行洗滌,每樣試劑洗滌3次;將洗滌后的產(chǎn)物通過真空冷凍干燥機(jī),于溫度50 ℃,真空度為20～100 MPa的條件下進(jìn)行凍干處理,將凍干樣品取出放置至室溫,獲得普洱茶茶渣茶多糖樣品。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 浸提溫度的確定 固定浸提時(shí)間為90 min、料液比為1∶40、超聲波功率為400 W的基礎(chǔ)因素條件,研究不同浸提溫度(20、40、60、80、100 ℃)對(duì)茶多糖得率的影響。

1.2.2.2 浸提時(shí)間的確定 固定浸提溫度為60 ℃、料液比為1∶40、超聲波功率為400 W的基礎(chǔ)因素條件,研究不同浸提時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)茶多糖得率的影響。

1.2.2.3 料液比的確定 固定浸提溫度為60 ℃、浸提時(shí)間為90 min、超聲波功率為400 W的基礎(chǔ)因素條件,研究不同料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)對(duì)茶多糖得率的影響。

1.2.2.4 超聲功率的確定 固定浸提溫度為60 ℃、浸提時(shí)間為90 min、料液比為1∶40的基礎(chǔ)因素條件,研究不同超聲功率(100、200、400、600、800 W)對(duì)茶多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),以浸提溫度(X1)、浸提時(shí)間(X2)、料液比(X3)以及超聲波功率(X4)為自變量,茶多糖得率(Y)為響應(yīng)面值,制定茶多糖提取工藝的4因素3水平響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.4 茶多糖得率測定 采用蒽酮比色法用于測定最終樣品中的茶多糖含量[12]。

茶多糖得率(%)=m/M×100

式中,m為茶多糖的干重,g;M為供試樣品重量,g[13]。

1.2.5 抗氧化性研究

羥基自由基清除率(%)=(A0-(Ax-Ax0))/A0×100

式中,Ao為空白對(duì)照樣品的吸光度;AX為待測溶液樣品的吸光度;AXo為待測溶液樣品的底吸光度。

超氧陰離子自由基清除率(%)=(A0-Ax)/A0×100

式中,Ao為空白對(duì)照液的吸光度;AX為待測溶液后的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面法回歸模型的構(gòu)建以及模型結(jié)果的分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 浸提溫度對(duì)茶多糖得率的影響 通過圖1分析發(fā)現(xiàn),在浸提溫度為20～80 ℃的范圍內(nèi),茶多糖得率隨著浸提溫度的升高而增加;在浸提溫度為80～100 ℃的范圍內(nèi),茶多糖得率隨著浸提溫度的升高呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢。主要是因?yàn)楫?dāng)浸提溫度過低時(shí),茶多糖容易提取不充分,而當(dāng)浸提溫度過高時(shí),有可能會(huì)導(dǎo)致茶多糖的降解[17]。在浸提溫度試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi),當(dāng)浸提溫度為80 ℃時(shí),茶多糖得率達(dá)到最高,為2.02%。因此,在響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中,浸提溫度的0水平應(yīng)當(dāng)為80 ℃為宜。

圖1 溫度對(duì)茶多糖得率的影響Fig.1 The effect of temperatureon the yield of tea polysaccharide

2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)茶多糖得率的影響 通過圖2分析發(fā)現(xiàn),在浸提時(shí)間為30～90 min的范圍內(nèi),茶多糖得率隨著浸提時(shí)間的延長而增加;在浸提時(shí)間為90～150 min的范圍內(nèi),茶多糖得率隨著浸提時(shí)間的延長而緩慢下降。通常情況下,茶多糖得率與浸提時(shí)間之間會(huì)存在一個(gè)時(shí)間平衡點(diǎn),而低于或超出這個(gè)時(shí)間平衡點(diǎn),都會(huì)導(dǎo)致茶多糖得率的下降[18]。在浸提時(shí)間試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi),當(dāng)浸提時(shí)間為90 min時(shí),茶多糖得率達(dá)到最高,為1.99%。因此,在響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中,浸提時(shí)間的0水平應(yīng)當(dāng)為90 min為宜。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)茶多糖得率的影響Fig.2 The effect of extraction timeon the yield of tea polysaccharide

2.1.3 料液比對(duì)茶多糖得率的影響 通過分析圖3發(fā)現(xiàn),在料液比為1∶20～1∶40 g/mL的范圍內(nèi),茶多糖得率隨著料液比比值的減少而增加;在料液比為1∶40～1∶60 g/mL的范圍內(nèi),茶多糖得率隨著料液比比值的減少而降低。出現(xiàn)這樣的變化趨勢可能是因?yàn)樘崛〉牟瓒嗵菚?huì)在料液比1∶40的情況下達(dá)到飽和狀態(tài),如果進(jìn)一步增大料液比會(huì)稀釋提取的茶多糖的濃度,從而造成提取率的下降。在料液比試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi),當(dāng)料液比為1∶40 g/mL時(shí),茶多糖得率達(dá)到最高,為2.04%。因此,在響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中,料液比的0水平應(yīng)當(dāng)為1∶40 g/mL為宜。

2.1.4 超聲波功率對(duì)茶多糖得率的影響 通過分析圖4發(fā)現(xiàn),在超聲波功率為100～400 W的范圍內(nèi),茶多糖得率隨著超聲波功率的增加而增大;在超聲波功率為400～800 W的范圍內(nèi),茶多糖得率隨著超聲波功率的增加而降低。出現(xiàn)這樣的變化趨勢可能是由于兩方面的原因:一是隨著功率的增大,反應(yīng)溶液中產(chǎn)生的氣泡越來越多,由此產(chǎn)生隔離現(xiàn)象,從而阻礙了超聲波在反應(yīng)容器中的傳播,致使遠(yuǎn)離超聲波源的區(qū)域作用效果減弱,從而使整個(gè)樣品的提取反應(yīng)不均勻[19];二是功率過大可能會(huì)導(dǎo)致茶多糖的降解,從而降低其提取率。在超聲波功率試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi),當(dāng)超聲波功率為400 W時(shí),茶多糖得率達(dá)到最高,為1.91%。因此,在響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中,超聲波功率的0水平應(yīng)當(dāng)為400 W為宜。

圖4 超聲波功率對(duì)茶多糖得率的影響Fig.4 The effect of rultrasonic poweron the yield of tea polysaccharide

2.2 響應(yīng)面工藝參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 優(yōu)化試驗(yàn)方案 依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)的設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

2.2.2 回歸模型構(gòu)建與方差分析 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。回歸方程的方差分析及偏回歸系數(shù)檢驗(yàn)見表3。回歸方程為:

由表3回歸方程的方差結(jié)果可知,F失擬=1.99

由表3中回歸方程的偏回歸系數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果,可以得出如下結(jié)論:

在四個(gè)試驗(yàn)因素的一次項(xiàng)中,X1、X2、X3對(duì)Y的影響極顯著(p<0.01);X4對(duì)Y的影響顯著(p<0.05)。

X1X3、X1X4、X2X3與Y呈正相關(guān);X1X2、X2X4、X3X4與Y呈負(fù)相關(guān)。其中,X1X4、X2X3對(duì)Y的影響呈現(xiàn)出極顯著水平(p<0.01);X2X4對(duì)Y的影響呈現(xiàn)出顯著水平(p<0.05);X1X3、X1X2、X3X4對(duì)Y的影響不顯著。

圖5進(jìn)一步展示了四個(gè)試驗(yàn)因素響應(yīng)面3D曲線及等高線分布情況。從這6張響應(yīng)面圖的等高線分布情況以及極值點(diǎn)出現(xiàn)情況可以看出,在四個(gè)試驗(yàn)因素交互作用中存在理論上的極值。對(duì)比6張響應(yīng)面圖中的3D曲線陡峭程度可知,X2與X3交互作用的3D曲線陡峭程度最為突出,這就表明,X2與X3的交互項(xiàng)對(duì)Y的影響相對(duì)于其它交互項(xiàng)的影響而言,更為顯著。同時(shí),6張響應(yīng)面圖3D曲線陡峭程度也與表3中交互項(xiàng)的方差分析結(jié)果相一致。

圖5 交互項(xiàng)的響應(yīng)面3D曲線及等高線分布圖Fig.5 The 3D curve and contour map of the response surface of the interaction term

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果及偏回歸系數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Variance analysis and test result of partial regression coefficient of regression equation

2.2.3 最優(yōu)試驗(yàn)因素參數(shù)組合選擇與驗(yàn)證試驗(yàn) 利用Design-Expert軟件包的極值分析工具對(duì)回歸方程進(jìn)行分析,由此可以獲得回歸方程極值點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)因素組合,即浸提溫度100 ℃、浸提時(shí)間120 min、料液比1∶30 g/mL,超聲波功率422.95 W,此時(shí)茶多糖得率能夠取得理論上的最大值2.32%。考慮到超聲波儀器的實(shí)際可操作性,最佳的試驗(yàn)因素組合取值應(yīng)為:浸提溫度為100 ℃、浸提時(shí)間為120 min、料液比為1∶30 g/mL,超聲波功率為420 W。

用最佳的試驗(yàn)因素組合進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn),分別測定所得樣品的茶多糖得率,三個(gè)樣品的茶多糖得率平均值為2.29%。理論上的茶多糖提得率最大值為2.32%,實(shí)際獲得值與理論最大值的相對(duì)誤差為1.31%,在試驗(yàn)誤差允許的范圍之內(nèi),說明回歸方程擬合度較高,其最優(yōu)試驗(yàn)因素參數(shù)組合選擇較為準(zhǔn)確。

2.3 茶多糖抗氧化性試驗(yàn)

2.3.1 羥基自由基清除試驗(yàn) 羥基自由基氧化活性很強(qiáng),會(huì)對(duì)人體細(xì)胞造成很大的危害,從而致使多種疾病的產(chǎn)生[20]。從圖6可以看出,在茶多糖濃度為0.8～3.2 mg/mL的范圍內(nèi),茶多糖對(duì)羥基自由基的清除率隨著茶多糖濃度的提升而增加,之后在茶多糖濃度為3.2～4.0 mg/mL的范圍內(nèi),茶多糖對(duì)羥基自由基的清除率略微下降。當(dāng)茶多糖濃度為3.2 mg/mL時(shí),茶多糖對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到最高,為60.37%。于淑池等[21]研究證明,龍井茶多糖對(duì)羥基自由基的清除率最高可達(dá)68.1%。相比之下,經(jīng)過超聲波輔助提取的普洱茶茶渣中的茶多糖依然對(duì)羥基自由基具有較強(qiáng)的清除效果。

圖6 茶多糖對(duì)羥基自由基的清除率Fig.6 Effect of tea polysaccharideon hydroxyl radical scavenging rate

2.3.2 超氧陰離子自由基清除試驗(yàn) 盡管超氧陰離子自由基是人體內(nèi)存在的一種相對(duì)較弱的氧化劑,但它仍然會(huì)通過DNA和細(xì)胞膜的破壞而導(dǎo)致人體機(jī)體受損。從圖7可以看出,在茶多糖濃度為0.8～2.4 mg/mL的范圍內(nèi),茶多糖對(duì)超氧離子自由基的清除率隨著茶多糖濃度的提升而增加,之后在茶多糖濃度為2.4～4.0 mg/mL的范圍內(nèi),茶多糖對(duì)超氧離子自由基的清除率呈下降趨勢。當(dāng)茶多糖濃度為2.4 mg/mL時(shí),茶多糖對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到最高,為53.91%。于淑池等[21]研究證明,龍井茶多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率最高可達(dá)72.1%。相比之下,經(jīng)過超聲波輔助提取的普洱茶茶渣中的茶多糖仍然對(duì)超氧離子自由基具有較強(qiáng)的清除效果。

圖7 茶多糖對(duì)超氧離子自由基的清除率Fig.7 Effect of tea polysaccharideon superoxide anion radical scavenging rate

3 結(jié)論與討論

高茶多糖提取率的最佳試驗(yàn)因素參數(shù)組合為:浸提溫度100 ℃、浸提時(shí)間120 min、料液比1∶30 g/mL,超聲波功率420 W。在此條件下得到茶多糖得率的理論值為2.32%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)測得實(shí)際茶多糖得率為2.29%,實(shí)際獲得值與理論最大值的相對(duì)誤差為1.31%,表明回歸方程結(jié)果可信,最優(yōu)試驗(yàn)因素組合選擇較為準(zhǔn)確。

對(duì)經(jīng)過超聲波輔助提取的普洱茶茶渣中的茶多糖進(jìn)行抗氧化性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),提取后的茶多糖對(duì)羥基自由基以及超氧離子自由基均具有較強(qiáng)的清除能力。其中,當(dāng)茶多糖濃度為3.2 mg/mL時(shí),茶多糖對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到最高,為60.37%;當(dāng)茶多糖濃度為2.4 mg/mL時(shí),茶多糖對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到最高,為53.91%。黃永春[22]等在研究超聲波輔助提取茶多糖及其分子量變化后,指出超聲波輔助提取會(huì)造成茶多糖的降解,從而可能會(huì)影響茶多糖的部分應(yīng)用屬性。本實(shí)驗(yàn)研究證明,經(jīng)過超聲波輔助提取的普洱茶茶渣中的茶多糖依然具有較強(qiáng)的抗氧化性,這進(jìn)一步拓展了經(jīng)過超聲波輔助提取的普洱茶茶渣中的茶多糖的應(yīng)用方向。