桑葉茯磚茶多糖的響應面提取工藝優化及其體外抗氧化降血脂作用

曾 橋,韋承伯,韓國鋒,韋文龍,蔣佳琪

(1.陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安 710021;2.陜西科技大學輕工科學與工程學院,陜西西安 710021;3.陜西農產品加工技術研究院,陜西西安 710021;4.陜西樸道茯茶股份有限公司,陜西咸陽 713700)

桑葉為桑科(Moraceae)植物桑(MorusalbaL.)的葉,又名鐵扇子[1],兼具食藥用價值,《中國藥典》記載其有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目等功效,用于風熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花[2],由于食藥用歷史悠久,1993年原國家衛生部將其列為藥食同源物質。現代藥理研究結果表明,桑葉含有豐富的黃酮、多糖、氨基酸、生物堿等活性成分,具有降血糖[3]、降血脂[4]和膽固醇[5]、抗氧化[6]、調節內分泌、改善消化系統[7]、抗腫瘤[8]等作用。桑葉在我國分布廣泛,產量巨大,除少量用于養蠶和藥用外,每年有大量的桑葉未得到有效的利用而浪費。近年來,隨著人們對桑葉的研究及認識的深入,以桑葉為原料開發具有一定保健功能的食品,從而提高其利用價值越來越受到人們的重視。

隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強,具有保健功效和投資增值的傳統發酵茶受到了廣大消費者的青睞,這其中尤其以茯磚茶的發展最為迅速,成為茶品市場上的新亮點。茯磚茶屬后發酵茶,是所有茶類中加工工藝最復雜、生產加工周期最長、工藝最獨特的黑茶類產品[9]。茯磚茶內質金花普茂,菌香濃郁,開湯后湯色紅濃,滋味醇和,香氣純正[10],具有消食健胃、降脂減肥、降血糖、抗腫瘤、保肝護肝等功效。桑葉屬于可再生資源、產量大、價格低廉,加之有制茶的歷史,是制作茯磚茶的理想原料。通過將桑葉發酵制作成桑葉茯磚茶,對于提高桑葉利用率,增加產品附加值,促進農民增收具有重要意義。

本文前期以桑葉為原料,經采摘、干燥、渥堆、汽蒸、成型、發花、陳化等工藝制作而成桑葉茯磚茶的基礎上,進一步對桑葉茯磚茶多糖提取工藝進行優化研究,并考察桑葉茯磚茶多糖的抗氧化活性及降血脂作用,從而為桑葉茯磚茶的飲用以及進一步開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉茯磚茶 所用原料桑葉為霜桑葉,2016年11～12月采摘于陜西漢中勉縣,經陜西科技大學藥學系鑒定為?？浦参锷?MorusalbaL.)的葉,后在陜西樸道茯茶股份有限公司制作而成;葡萄糖標準品 上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%;胃蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司,BR,1∶250;胰蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司,USP級,1∶30000;濃硫酸、濃鹽酸、水楊酸 國藥集團化學試劑有限公司;氫氧化鈉、30%雙氧水 天津市科密歐化學試劑有限公司;苯酚、過硫酸鉀、無水乙醇、鐵氰化鉀、抗壞血酸(VC) 天津市天力化學試劑有限公司;硫酸亞鐵 廣東光華科技股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、ABTS二胺鹽、甘氨膽酸鹽、?；悄懰猁} 上海源葉生物科技有限公司。

TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FA1004N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司;DZ-2BC型真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;RE52CS-1旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;GZX-9246MBE電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;TD5A大容量低速離心機 長沙英泰儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葉茯磚茶預處理 取桑葉茯磚茶1塊(500 g),將其掰開捏碎,置于50 ℃真空干燥箱中干燥至恒重后,粉碎過60目篩,得桑葉茯磚茶粉末備用。

1.2.2 桑葉茯磚茶多糖水提工藝流程 精密稱定桑葉茯磚茶粉末→熱水提取→冷卻至室溫→離心(4000 r/min)15 min→取上清液→抽濾→得多糖提取液。

1.2.3 多糖含量的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制 精密稱取干燥至恒重葡萄糖標準品10 mg,用蒸餾水溶解定容至100 mL,得0.1 mg/mL葡萄糖標準儲備液備用。精密量取葡萄糖標準儲備液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,加蒸餾水稀釋定容,搖勻,得濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的葡萄糖標準工作液。精密量取各濃度葡萄糖標準工作液2 mL至具塞錐形瓶中,加入5%苯酚溶液1 mL,搖勻,迅速加入濃硫酸5 mL,搖勻,于沸水浴中水解15 min,取出,冷卻至室溫,待測。另取蒸餾水2 mL按上述條件處理作空白對照。于490 nm處測吸光度。以標準溶液濃度(X)為橫坐標,吸光度(Y)為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3.2 桑葉茯磚茶多糖含量的測定 精密稱取1.2.1中的桑葉茯磚茶粉末2 g,按1.2.2中的方法進行操作獲得桑葉茯磚茶多糖提取液,用蒸餾水定容至100 mL,進一步精密吸取1.0 mL至50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容;進一步地精密吸取2 mL至具塞錐形瓶中,按1.2.3.1“加入5%苯酚溶液1 mL……待測”操作,另取蒸餾水2 mL按上述條件處理作空白對照。于490 nm處測吸光度。將所測吸光度值代入葡萄糖標準曲線回歸方程中,計算得樣品溶液中多糖的濃度,按稀釋倍數計算得多糖含量。

1.2.3.3 桑葉茯磚茶多糖得率的計算

多糖得率(%)=[(Y×V×D)/(B×106)]×100

式中:Y為多糖濃度(μg/mL);V為樣品溶液體積(mL);D為稀釋倍數;B為原料重量(g);106為質量換算系數。

1.2.4 單因素實驗 以桑葉茯磚茶多糖得率為考察指標,分別考察提取溫度、提取時間、液料比以及提取次數對得率的影響。

1.2.4.1 提取溫度對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 精密稱取桑葉茯磚茶試樣2 g,在提取次數為1次,提取時間為2 h,液料比為20 mL/g下,分別考察提取溫度40、50、60、70、80、90 ℃對桑葉茯磚茶多糖得率的影響。

1.2.4.2 提取時間對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 精密稱取桑葉茯磚茶試樣2 g,在提取次數為1次,提取溫度為80 ℃,液料比為20 mL/g下,分別考察提取時間為0.5、1、1.5、2、2.5 h對桑葉茯磚茶多糖得率的影響。

1.2.4.3 液料比對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 精密稱取桑葉茯磚茶試樣2 g,在提取次數為1次,提取時間為2 h,提取溫度為80 ℃下,分別考察液料比為8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1、32∶1 mL/g對桑葉茯磚茶多糖得率的影響。

1.2.4.4 提取次數對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 精密稱取桑葉茯磚茶試樣2 g,在提取時間為2 h,液料比為20 mL/g,提取溫度為80 ℃下,分別考察提取次數為1、2、3次對桑葉茯磚茶多糖得率的影響。

1.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上,以提取溫度,提取時間以及液料比為自變量,利用Design Expert 8.0.6軟件進行三因素三水平的Box-Behnken中心組合實驗設計,其實驗因素和水平設計見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.6 體外抗氧化活性研究

1.2.6.1 DPPH自由基清除活性測定 參照文獻[11]稍加改進。稱取一定量DPPH粉末,用無水乙醇配制成濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液。用蒸餾水將桑葉茯磚茶多糖母液稀釋成8、16、24、32、40、48、56、64、72、80 μg/mL的濃度梯度。取10支潔凈具塞試管,分別依次加入DPPH溶液2 mL,各濃度梯度桑葉茯磚茶多糖溶液2 mL,劇烈振搖,室溫放置30 min,以蒸餾水調零,于517 nm處測吸光度記為A樣品。用蒸餾水代替DPPH溶液按上述方法處理測定吸光度記為A對照,以蒸餾水代替桑葉茯磚茶多糖提取液按上述方法處理測定吸光度記為A空白。同時,以VC為陽性對照。按下式計算DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

1.2.6.2 ABTS+·清除活性測定 參照文獻[12]和[13]稍加改進。將8.1 mmol/L ABTS溶液與3.2 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合,暗處放置16 h,使用時用無水乙醇稀釋至其在734 nm 波長處A為0.70左右。分別取質量濃度為10、30、50、70、90、110、130 μg/mL桑葉茯磚茶多糖提取液1 mL置于具塞試管中,加入4 mL ABTS+·溶液,室溫避光反應6 min,在734 nm下,測其吸光度記為A樣品;以1 mL蒸餾水代替桑葉茯磚茶多糖溶液為空白組,測吸光度記為A空白,以上測定時均以蒸餾水調零。同時,以VC為陽性對照。按下式計算ABTS+·清除率:

ABTS+·清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100

1.2.6.3 ·OH清除活性測定 參照文獻[14]稍加改進。于不同試管中分別加入質量濃度為0.175、0.35……1.75、1.925 mg/mL桑葉茯磚茶多糖溶液2 mL,每支試管依次加6 mmol/L 的FeSO4溶液2 mL,6 mmol/L的H2O2溶液2 mL,搖勻,靜置10 min,進一步加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL 搖勻,于37 ℃水浴30 min,0.45 μm微孔濾膜濾過,以蒸餾水調零,于510 nm 測吸光值,記為A樣品。以蒸餾水代替桑葉茯磚茶多糖提取液按上述方法測定吸光度,記為A空白;用蒸餾水代替水楊酸按上述方法測定吸光度,記為A對照。同時,以VC為陽性對照,按下式計算·OH清除率:

·OH清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

1.2.7 降血脂作用研究

1.2.7.1 繪制膽酸鹽標準曲線 參照文獻[15]的方法,略作修改,分別繪制甘氨膽酸鹽和牛磺膽酸鹽標準曲線。取不同濃度的標準溶液(甘氨膽酸鹽0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L,?；悄懰猁}0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L)2 mL分別置于不同具塞試管中,分別加入6 mL質量分數60%的H2SO4溶液于70 ℃水浴20 min,取出冰浴5 min,在387 nm波長處測定吸光度。以膽酸鹽含量為橫坐標,吸光度為縱坐標分別繪得甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}標準曲線。

1.2.7.2 膽酸鹽結合實驗 參照文獻[15]的方法,略作修改,移取質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL桑葉茯磚茶多糖溶液3 mL于100 mL具塞三角瓶中,每個三角瓶分別加入10 mg/mL胃蛋白酶溶液3 mL和0.01 mol/L的HCl溶液1 mL,在37 ℃下恒溫水浴振蕩消化1 h(模擬胃消化環境)。隨后以0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH至6.3,加入10 mg/mL胰蛋白酶溶液4 mL,在37 ℃下恒溫水浴振蕩消化1 h(模擬腸道環境)。每個樣品中加入0.4 mmol/L甘氨膽酸鹽4 mL或0.5 mmol/L牛磺膽酸鹽4 mL,繼續恒溫水浴振蕩1 h,于4000 r/min離心20 min,取上清液,于387 nm處測定吸光度值,按照標準曲線計算剩余甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}含量,所加入甘氨膽酸鹽或?；悄懰猁}總量減去剩余量所得差值與總量的比值即為結合率,以百分比表示。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次,響應面優化實驗數據采用Design-Expert 8.0.6軟件進行二次回歸分析及方差分析,其余實驗結果均采用Graph Pad Prism軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

按1.2.3.1項下規定所繪制的葡萄糖標準曲線,回歸方程為:y=0.0671x+0.0021,相關系數R2=0.9998,線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 單因素對桑葉茯磚茶多糖得率的影響

2.2.1 提取溫度對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 如圖2所示,提取溫度在40～50 ℃區間內時,桑葉茯磚茶多糖得率隨溫度的升高而增大,在50 ℃時,得率最大,這是由于溫度越高,分子熱運動越快,多糖溶出速度也就快,此外,溫度升高還能增加多糖溶解度。當溫度超過50 ℃繼續升高時,多糖得率則開始緩慢下降,這是因為過高的溫度會使得多糖部分水解從而造成得率下降。因此,合理的提取溫度為50 ℃,這與文獻[16-17]研究的多糖最適提取溫度為70～80 ℃不同,可能的原因包括桑葉多糖和其他種類多糖在結構上可能有區別,另外,茯磚茶制作過程中,由于高溫高濕的環境以及微生物的作用,可能導致糖的組成和結構發生變化[18],從而使得桑葉茯磚茶多糖的最佳提取溫度發生變化。

圖2 提取溫度對桑葉茯磚茶多糖得率的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

2.2.2 提取時間對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 由圖3可知,隨著提取時間的延長,桑葉茯磚茶多糖的得率先呈較快的增長,但是當提取時間增加到1.5 h后,得率趨于平穩甚至有緩慢下降趨勢。由于在初始階段,提取液中多糖濃度較低,因而溶出就較快,隨著提取時間的延長,提取液中多糖濃度逐漸增大,溶液逐步趨于飽和達到平衡狀態,從而導致多糖溶出速率降低,因此,在后期延長提取時間,得率變化不大。綜合考慮能耗和節約時間等因素,選擇最佳提取時間為1.5 h。

圖3 提取時間對桑葉茯磚茶多糖得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

2.2.3 液料比對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 由圖4可知,當液料比小于12∶1 mL/g時,桑葉茯磚茶多糖的得率隨著液料比的增加顯著增大,當液料比大于12∶1 mL/g時,多糖得率繼續緩慢增加,當液料比大于16∶1 mL/g時,多糖得率明顯降低,而當液料比大于24 mL/g時,桑葉茯磚茶多糖的得率則呈緩慢降低的趨勢。這可能是由于水量過大導致后續工序能耗增加,效率降低[19]。因此,桑葉茯磚茶多糖提取的最佳液料比確定為16∶1 mL/g。

圖4 液料比對桑葉茯磚茶多糖得率的影響Fig.4 The effect of liquid-solid ratio on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

2.2.4 提取次數對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 由圖5可知,當提取次數為1時,桑葉茯磚茶多糖得率為11.10%,復提之后合并提取液,多糖得率為11.80%,得率變化極顯著(p<0.01),累計3次,多糖總得率為11.79%,得率變化不顯著(p>0.05)。雖然提取2次和1次相比,多糖得率變化極顯著(p<0.01),然而得率僅增加0.70%,若以最大得率11.80%為對照,提取1次即可獲得桑葉茯磚茶中94.07%的多糖,而增加提取次數不僅增加能耗,而且浪費時間,從經濟角度考慮,選擇提取1次為宜。

圖5 提取次數對桑葉茯磚茶多糖得率的影響Fig.5 The effect of extraction times on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick Tea

2.3 響應面優化桑葉茯磚茶多糖提取工藝

2.3.1 Box-Behnken中心組合實驗設計及結果 在單因素實驗基礎上,根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理,確定以提取時間(A)、液料比(B)、提取溫度(C)為基礎設計三因素三水平共17組響應面分析實驗。實驗因素和水平設計見表1,實驗方案設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken中心組合實驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

2.3.2 回歸模型的建立及顯著性分析 以桑葉茯磚茶多糖得率為響應值,對中心組合的實驗結果進行回歸分析,獲得一個二次多項回歸方程:

Y=-71.46543+9.44485A+1.01308B+2.60778C-0.071741AB-0.015790AC+1.10438×10-3BC-2.34874A2-0.029232B2-0.025601C2

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.3.3 響應面優化分析 采用Design Expert 8.0.6軟件繪制得響應面曲面圖和等高線圖,如圖6～圖8,分別表示提取時間(A)和液料比(B)、提取時間(A)和提取溫度(C)、液料比(B)和提取溫度(C)的交互作用的響應曲面圖和等高線圖。

圖6 提取時間和液料比對桑葉茯磚茶多糖得率影響的響應面圖Fig.6 Response surface of effects of extraction time and liquid-solid ratio on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

圖7 提取時間和提取溫度對桑葉茯磚茶多糖得率影響的響應面圖Fig.7 Response surface of effects of extraction time and extraction temperature on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

圖8 提取溫度和液料比對桑葉茯磚茶多糖得率影響的響應面圖Fig.8 Response surface of effects of extraction temperature and liquid-solid ratio on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

由圖6a可知,提取時間和液料比對桑葉茯磚茶多糖得率的影響較顯著,當液料比一定時,多糖得率隨提取時間的延長而增加,但是當時間延長到一定程度后繼續延長時間,多糖得率則開始下降。圖6b等高線圖表明,在液料比和提取時間兩個因素中,時間對多糖得率的影響較液料比大。圖7a和圖8a響應面圖表明,提取溫度和提取時間以及提取溫度和液料比對桑葉茯磚茶多糖得率的影響均較顯著,當提取溫度一定時,多糖得率隨提取時間的延長先增大后減小,隨液料比的增大先增大后減小。圖7b等高線圖表明,當液料比一定時,等高線圖呈圓形,表明提取時間和溫度交互作用不顯著。圖8b等高線圖表明,在液料比和提取溫度兩個因素中,溫度對多糖得率的影響較液料比大。

在單因素實驗基礎上,采用響應面法對桑葉茯磚茶多糖提取工藝進行優化,經模型預測,最佳提取條件為:提取時間1.59 h,液料比為16.34∶1 mL/g,提取溫度50.80 ℃,提取次數為1次,在此最佳工藝條件下,桑葉茯磚茶多糖得率為10.55%?？紤]到實際操作可行性和方便性,對各個工藝參數稍作修改,即最佳工藝條件為:提取時間1.6 h,液料比16∶1 mL/g,提取溫度51 ℃,提取次數1次,平行進行3次驗證性實驗,桑葉茯磚茶多糖得率為10.43%(SD=0.1123),與預測值相對誤差為1.14%,表明該最佳條件參數準確、可行。

2.4 桑葉茯磚茶多糖體外抗氧化降血脂活性研究

2.4.1 體外抗氧化活性評價

2.4.1.1 DPPH自由基清除作用 從圖9可以看出,桑葉茯磚茶多糖對DPPH自由基具有較好的清除作用,其對DPPH自由基的清除效果隨濃度的增大而增大,當桑葉茯磚茶多糖濃度大于56 μg/mL時,繼續增大濃度,清除率增加緩慢。當桑葉茯磚茶多糖濃度達到80 μg/mL時,其對DPPH自由基的清除率達到84.35%。

圖9 不同質量濃度桑葉茯磚茶多糖對DPPH自由基清除作用Fig.9 Scavenging activity of polysaccharide from mulberry leaves of fu brick tea at various concentrations against DPPH free radicals

2.4.1.2 ABTS+·清除作用 由圖10可以看出,桑葉茯磚茶多糖對ABTS+具有較好的清除作用,清除能力較VC弱。隨著桑葉茯磚茶多糖質量濃度的增大,對ABTS+的清除率呈上升趨勢。當質量濃度大于70 μg/mL時,繼續增大濃度,清除率增加緩慢,當質量濃度達到130 μg/mL時,其對ABTS+的清除率可達72.30%。

圖10 不同質量濃度桑葉茯磚茶多糖對ABTS+·清除作用Fig.10 Scavenging activity of polysaccharide from mulberry leaves of fu brick tea at various concentrations against ABTS+·

2.4.1.3 對·OH的清除作用 由圖11可知,隨著桑葉茯磚茶多糖和VC質量濃度的上升,對·OH的清除率呈上升趨勢,當質量濃度為0.875 mg/mL時,桑葉茯磚茶多糖對·OH的清除率為56.10%,繼續增大濃度,清除能力增加緩慢。當桑葉茯磚茶多糖濃度為1.75 mg/mL時,對·OH的清除率為74.08%,此時清除能力達到最大值,繼續增大濃度,清除率不再增加。

圖11 不同質量濃度桑葉茯磚茶多糖對·OH自由基清除作用Fig.11 Scavenging activity of polysaccharide from mulberry leaves of fu brick tea at various concentrations against ·OH

2.4.2 體外降血脂研究

2.4.2.1 甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}標準曲線 甘氨膽酸鹽標準曲線回歸方程為:y=3.4857x+0.0047,R2=0.9995,線性關系良好。

?；悄懰猁}標準曲線回歸方程為:y=2.3696x+0.0051,R2=0.9992,線性關系良好。

2.4.2.2 桑葉茯磚茶多糖對膽酸鹽的結合能力 研究表明,膽汁酸能夠促進脂類水解和吸收,若膽汁酸被其他物質結合,則膳食中脂肪的吸收和利用便會得到抑制,從而達到降低血脂的目的。此外,一些食品成分能與膽汁酸結合,加速體內膽固醇的分解,有效降低人體血清和肝中膽固醇的含量。正常人膽汁酸中90%為結合型膽汁酸,在體內一般以鈉鹽形式存在,本研究選取甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c為結合對象,模擬人胃和腸道的環境,考察桑葉茯磚茶多糖對二者的結合能力,從而評價其降血脂效果[15,20]。

圖12 甘氨膽酸鹽標準曲線Fig.12 Standard curve of glycine sodium cholate

圖13 ?；悄懰猁}標準曲線Fig.13 Standard curve of taurine sodium cholate

從圖14可以看出,桑葉茯磚茶多糖和甘氨膽酸鹽、?；悄懰猁}的結合量均隨多糖濃度的增大而增大。當多糖濃度達到2.5 mg/mL時,桑葉茯磚茶多糖和牛磺膽酸鹽、甘氨膽酸鹽的結合率分別達到58.28%和39.95%,繼續增加濃度,結合率上升緩慢。當濃度達到3.5 mg/mL時,桑葉茯磚茶多糖和?；悄懰猁}、甘氨膽酸鹽的結合率分別達到59.96%和41.97%。桑葉茯磚茶多糖與?；悄懰猁}的結合量比甘氨膽酸鹽的結合量多,即桑葉茯磚茶多糖與?；悄懰猁}的結合能力更強。膽酸鹽結合實驗結果表明,桑葉茯磚茶多糖降血脂作用較好。

圖14 桑葉茯磚茶多糖對膽酸鹽結合能力Fig.14 The capacity of polysaccharide from mulberry leaves of fu brick tea to bind sodium cholate

3 結論

在單因素實驗基礎上,采用響應面法優化了桑葉茯磚茶多糖的提取工藝,結果表明,最佳提取工藝為提取時間1.6 h,液料比16∶1 mL/g,提取溫度51 ℃,提取次數1次,在此最佳條件下,桑葉茯磚茶多糖得率為10.43%。體外抗氧化研究結果表明,桑葉茯磚茶多糖具有較好的抗氧化活性,其對DPPH自由基、ABTS+、·OH的清除能力隨多糖濃度的增大而增大,呈現一定的劑量-效應關系。膽酸鹽結合實驗結果表明,桑葉茯磚茶多糖對甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}均有較強的結合能力,相較于甘氨膽酸鹽,桑葉茯磚茶多糖對牛磺膽酸鹽的結合能力較強,說明桑葉茯磚茶多糖具有較好的降血脂作用。

本文所用桑葉為霜桑葉,即初霜后采收干燥而得,此階段的桑葉藥用價值最高。采用茯磚茶加工工藝制作而成的桑葉茯磚茶具有普通茯磚茶金花普茂,菌香濃郁,開湯后湯色紅濃,滋味醇和,香氣純正等特征[10],其品質較普通桑葉茶大大提高。桑葉茯磚茶多糖含量豐富,具有較好的抗氧化活性和降血脂等保健作用,長期飲用對身體有益。采用水提法對所用桑葉原料中的多糖進行提取,得率為12.83%,較桑葉茯磚茶多糖含量高,這可能是由于茯磚茶發酵過程中,冠突散囊菌部分利用了其中所含的多糖[21]。冠突散囊菌是茯磚茶發酵過程中的優勢菌,其生長繁殖能產生大量有益的次生代謝產物,因而冠突散囊菌的數量是評價茯磚品質的重要指標。后續研究過程中,應進一步探討桑葉茯磚茶發酵過程中多糖的含量變化與冠突散囊菌生長繁殖的相關性,從而調控冠突散囊菌的生長代謝過程,這對于指導桑葉茯磚茶的生產具有重要作用,可以在保證產品品質的同時,盡量減少多糖的損失,以最大程度發揮桑葉茯磚茶的保健功效。