高效液相色譜分析真菌液態發酵產物中的麥角硫因

許 晟,劉 琦,姜文俠,王 妍,周子振

(1.天津中科諾識生物科技有限公司,天津 300100;2.天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308)

麥角硫因(ergothioneine,EGT),即巰基組氨酸三甲基內鹽,是一種天然抗氧化劑[1],具有清除自由基[2]、解毒,維持DNA的生物合成、細胞的正常生長以及細胞免疫等多種生理功能[3-6]。

EGT的制備方法主要有化學合成法、天然生物提取法[7-9]及生物合成法。其中生物合成法[10-14],即利用真菌菌絲體深層發酵合成EGT,是合成EGT的發展方向。采用這種方式可以通過代謝調控提高產率,降低成本,并能夠保證產品的安全性,拓寬了EGT的應用空間。而建立EGT快速準確地檢測與分析方法,是發酵以及純化等后續工藝進行優化的前提,對于研究和生產都至關重要。國內外有學者采用C18色譜柱[15-18]、HILIC色譜柱[19]和氨基色譜柱[20]檢測EGT。其中C18色譜柱法對色譜柱損耗較大,檢測成本高,HILIC色譜柱法檢測時間較長,而氨基酸色譜柱法所用流動相中有機溶劑含量較大,檢測廢液對環境污染較嚴重。

本文利用反相耐水色譜柱Zorbax-SB-Aq建立了EGT的定量檢測方法,相較于以上方法,具有檢測時間短,流動相中有機溶劑含量低、污染小等優點,同時在菌絲體和發酵液等成分復雜樣品的檢測過程中,保持了良好的分離度和穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糙皮側耳(Pleurotusostreatus,CGMCC No. 6232) 保存于中國科學院天津工業生物技術研究所——姜文俠課題組;麥角硫因對照品(純度≥98%) Enzo Life Sciences公司;甲醇、乙酸(色譜級) 德國默克生物科技有限公司;玉米粉 梅河口市興達米業有限責任公司;豆粕粉 北京中棉紫光生物科技有限公司;磷酸二氫鉀、硫酸鎂 分析純，天津市北方天醫化學試劑廠;α-淀粉酶 美國Solarbio科技有限公司;甘油(分析純) 天津市風船化學試劑科技有限公司;胰酪胨 北京雙旋微生物培養基制品廠；PDA培養基 北京陸橋技術股份有限公司。

ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱 美國Agilent公司;ZORBAX Eclipse XDB-C18(5 μm,250 mm×4.6 mm)色譜柱 美國Agilent公司;1260 Infinity高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Agilent 1200-Sprak Prospekt2-Bruker AVANCE III 600 MHz/Bruker microOTOF-QII 液相質譜聯用儀 美國Agilent公司、德國Bruker公司;AX205DR電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;TGL-16M離心機 湖南湘儀有限公司;MS 3 digital漩渦振蕩器 德國IkA公司;超濾離心管(3 kDa,1.5 mL) 美國MiliPORE公司;Milli-Q Reference超純水機 美國MiliPORE公司;SCIENZE SB-5200D超聲清洗機 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 種子培養基：玉米粉30.0 g/L,豆粕粉15.0 g/L,磷酸二氫鉀3.0 g/L,硫酸鎂1.5 g/L,α-淀粉酶80 U/L,自然pH,500 mL三角瓶裝液量為150 mL,121 ℃滅菌20 min;

搖瓶發酵培養基：甘油50.0 g/L,胰酪胨35.0 g/L,KH2PO43.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,自然pH,500 mL三角瓶裝液量為150 mL,121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 發酵液的制備 發酵搖瓶培養方法:挑取CGMCC 6232斜面菌種約1 cm2,接種至種子培養基,25 ℃搖床150 r/min培養96 h,制備種子液。將種子液按體積比5%的接種量接入發酵培養基,25 ℃搖床150 r/min培養15 d,制備菌絲體發酵液。當培養基中甘油和胰酪胨的添加比例為5∶4和5∶3，其他培養條件同上時，得到兩個樣品分別為3-14d-1和3-14d-2；當在25 ℃搖床150 r/min下培養時間為254 h和304 h，其他培養條件同上時，得到兩個樣品分別為FJ-009-254h和FJ-009-304h。

1.2.3 樣品的前處理 取適量的菌絲體發酵液,置于90 ℃,300 r/min的磁力攪拌器上浸提30 min,取上清液經膜孔徑3 kDa的超濾管在12840×g的條件下離心10 min,透過液即為EGT待測樣品。

1.2.4 HPLC-MS檢測條件 離子源ESI,離子阱檢測器;檢測模式:正離子檢測;噴霧電壓:4.5 KV;氮氣流速:3 L/min;毛細管溫度:220 ℃;毛細管電壓:10 V;采用全離子掃描方式,掃描范圍:50～450 m/z。

1.2.5 HPLC檢測條件 色譜柱:兩根ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)串聯;流動相為A(純水:甲醇=95:5/V:V,使用硼酸和氨水調節流動相的pH至5.0);流速0.7 mL/min;檢測波長:257 nm;柱溫:25 ℃;進樣量:5 μL。

1.2.6 色譜條件的優化 分別對檢測波長、流動相組成與比例、流動相pH、流速和柱溫以及梯度條件進行了優化。

1.2.7 方法學驗證 對建立的檢測方法進行了專屬性考察、檢出限和定量限、精密性、線性范圍、穩定性考察(日內、日間穩定性)和加標回收率考察。

1.2.8 對照品溶液的配制及標準曲線的繪制 精密稱量10 mg的麥角硫因對照品,溶解于5 mL的超純水中,轉移至10 mL的容量瓶,使用超純水定容、混勻,配制成濃度為1000 mg/L的對照品儲備液,于-20 ℃冷凍保存。使用前,置于10 ℃水中自然融化,隨后分別取上述儲備液0.25、0.5、1、2、4 mL,稀釋至10 mL,配制成濃度為25、50、100、200和400 mg/L的對照品溶液,也可根據需要可按照比例配制其它濃度的對照品溶液,隨后進行HPLC測定,進樣量為5 μL,根據積分所得的峰面積與濃度繪制標準曲線。

1.2.9 雙C18色譜柱串聯檢測與SB-aq色譜柱檢測方法的對比實驗 分別進行對照品檢測對比實驗、相同樣品的檢測結果比較、以及利用液相-質譜聯用對兩種檢測方法進行驗證。

1.3 數據處理

本文數據處理軟件包括:Agilent液相色譜儀工作站 Chemstation Edition(版本C.01.07.SR3),Microsoft Office Excel 2007。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

2.1.1 檢測波長的確定 取適量EGT對照品溶液,先后在190～400 nm和250～270 nm范圍內進行紫外全波長掃描,確定EGT在257 nm處有最大吸收,故選擇257 nm作為檢測波長。掃描光譜圖見圖1a、圖1b。

圖1 EGT對照品的掃描光譜圖Fig.1 Scanning spectrum of EGT standard

2.1.2 流動相組成與比例的選擇和優化 選擇甲醇-水和乙腈-水作為流動相進行優化,兩種流動相對EGT的分離效果無明顯差別。如圖2～圖4所示,當流動相為甲醇∶水=10∶90和乙腈∶水=10∶90時,EGT與雜質峰的分離度分別為0.91和0.85,流動相為甲醇∶水=1∶99時,EGT與雜質峰的分離度為1.78。考慮到乙腈的毒性較大和價格較高,故采用甲醇-水作為流動相。實驗發現,甲醇與水的比例越小,EGT與雜質的分離效果越好。同時考慮到色譜柱保護的需要,將甲醇與純水的比例確定為1∶99。

圖2 甲醇∶水=10∶90的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of 10% methanol concentration

圖3 乙腈∶水=10∶90的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of 10% acetonitrile concentration

圖4 甲醇∶水=1∶99的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of 1% methanol concentration

2.1.3 流動相pH的優化 分別利用乙酸、甲酸、氨水、三乙胺等試劑調節流動相的pH至4.0～6.0,發現使用20%的乙酸和50%的氨水調節流動相的pH為5.0,EGT的峰形及與雜質的分離度最好。

2.1.4 流速和柱溫的優化 當流速從0.5 mL/min變化到1.5 mL/min時,EGT的峰形變窄,保留時間逐漸提前,由8 min左右變化至5 min左右,節省了檢測時間,但降低了與雜質的分離度。柱溫在20～35 ℃時,隨著溫度升高,EGT的保留時間提前,峰形變窄,但與雜質的分離度也降低。綜合考慮檢測時間、分離度和峰形,選擇流動相的流速為0.7 mL/min,柱溫為30 ℃。

2.1.5 梯度條件的選擇 由于發酵樣品雜質較多,若保持等度洗脫,隨著雜質的積累,會導致柱壓升高,影響檢測的穩定性,同時也會縮短色譜柱的使用壽命,增加檢測成本。因此建立了梯度洗脫建立程序:首先在50 min內完成B相0%～100%的變化,根據色譜圖,調整Δ%B和相應的時間,保持梯度陡度不變,減少色譜圖中的空白部分。將梯度時間再縮短1/3,觀察目標峰與雜質峰的分離效果(RS>1.5),在此前提下,進一步增大陡度以減少洗脫時間。最終建立的梯度洗脫程序如表1所示,在滿足了EGT與雜質良好分離的前提下,檢測時間達到最短。

表1 流動相的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2.2 方法學驗證

2.2.1 專屬性考察 取EGT對照品和搖瓶發酵樣品按照方法1.2.1和1.2.3進行處理,根據2.1優化的檢測條件進行檢測,檢測圖譜如圖5和圖6。由圖6可知,EGT的保留時間為5.863 min,與雜質峰的分離度為2.24,滿足中國藥典對于分離度的要求達到1.5以上。

圖5 EGT對照品的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of EGT standeard solution

圖6 EGT發酵樣品的HPLC圖譜Fig.6 HPLC chromatograms of EGT fermentation sample

利用液相質譜聯用儀對該方法進行專屬性驗證,結果如圖7。EGT的色譜峰與質荷比為230.096的EGT質譜信號基本重合,且該色譜峰內無其他質譜信號。考慮到質譜的死體積大于液相色譜,質譜峰的保留時間會略長于色譜峰,故未能完全重合。上述證明了液相色譜圖中所確定的色譜峰為EGT峰,且與雜質實現了良好的分離,專屬性符合檢測要求。

圖7 搖瓶發酵樣品的HPLC-MS圖譜Fig.7 HPLC-MS chromatograms of fermentation sample

2.2.2 檢出限和定量限 分別配制濃度范圍為0.01～1 μg/L的EGT對照品溶液,按照濃度由低到高的順序進行檢測,根據信噪比為3和10,確定EGT的檢出限和定量限分別是0.045和0.900 μg/L。

2.2.3 標準曲線的繪制 按照1.2.1所述方法精密配制濃度范圍為1～1000 mg/L的EGT對照品溶液,按2.1優化的檢測條件進行檢測,根據EGT的濃度與峰面積繪制標準曲線。如圖8,EGT在2.5～1000 mg/L的濃度范圍內線性關系良好,線性回歸方程為y=31.06x+273.31,R2為0.9991。

圖8 EGT對照品的標準曲線Fig.8 Standard curve of ergothioneine standeard solution

2.2.4 精密性試驗 取搖瓶發酵搖瓶樣品,按照1.2.3所述方法進行處理后,得到待測樣,連續進樣6次,檢測結果的相對偏差RSD為0.33%,說明該檢測方法的精密度良好。

2.2.5 穩定性考察

2.2.5.1 日內穩定性考察 取1份搖瓶發酵樣品于室溫下分別放置0、2、4、6、8、10、12 h,按照方法1.2.3處理后進行檢測,每個時間點的樣品平行測定3次,計算檢測結果的相對標準偏差RSD為1.89%,說明待測樣品中的EGT含量在12 h內保持穩定。

2.2.5.2 日間穩定性考察 另取1份搖瓶發酵樣品儲存在-20 ℃的冰箱中,于第1、7、11、14 d其進行檢測,四次檢測結果的RSD為0.026%,說明在14 d內,樣品中的EGT濃度保持穩定,日間穩定性良好。

2.2.6 加標回收率考察 取一份已知EGT含量的搖瓶發酵樣品,分別加入相當于樣品中EGT含量為75%、100%和125%的對照品溶液,根據檢測結果計算EGT的回收率,見表2。

表2 EGT加樣回收率的測定結果Table 2 The addition recovery of EGT

由表2得知,樣品的加標回收率都在90%～110%之間,符合定量檢測的要求[21]。

2.3 與雙C18色譜柱串聯檢測方法的比較

2.3.1 對照品檢測對比試驗 按照1.2.6進行試驗,結果見表3和表4,明顯可見,利用SB-aq色譜柱檢測時，相同濃度的麥角硫因對照品溶液峰面積一直穩定,而利用雙C18色譜柱檢測時，相同濃度的麥角硫因對照品溶液峰面積一直在變小,偏差較大。出現此現象的原因,可能與兩種色譜柱的調料不同有關。普通C18色譜柱的固定相疏水性較強,在高比例水相條件下,易引起固定相疏水塌陷,導致柱效迅速下降,影響響應強度,進而導致隨著使用時間變長,對照品峰面積逐漸變小,而SB-aq色譜柱的固定相具有較大的二異丙基側鏈基團,避免了色譜柱在低pH、高比例水相條件下被水解破壞,進而保證相同濃度對照品的峰面積能夠一直保持比較穩定的水平。

表3 利用SB-aq色譜柱對EGT對照品進行檢測結果Table 3 The result of ergothioneine standeard solution test in 4 weeks by SB-aq column

表4 利用雙C18色譜柱串聯對EGT對照品進行檢測結果Table 4 The result of ergothioneine standeard solution test in 4 weeks by C18 column

2.3.2 相同樣品的檢測結果比較 另取4個搖瓶發酵樣品,按1.2.3進行樣品制備,隨后利用兩種檢測方法進行檢測,結果如表5所示:對于4個不同樣品,兩種檢測方法的檢測結果均相差較大,采用SB-Aq色譜柱檢測樣品中的EGT含量低于C18柱檢測的同一樣品中的EGT含量。后續利用HPLC-MS對兩種方法進行驗證。

表5 同一樣品的兩種檢測方法檢測結果比較Table 5 Test results of same sample by two differert test methods

2.3.3 利用HPLC-MS驗證兩種檢測方法

2.3.3.1 對C18色譜檢測方法的質譜驗證 利用液相質譜聯用儀對C18柱分離的搖瓶發酵樣品3-14D-1和FJ-009-254 h進行色譜峰純度檢測,結果如圖9、圖10。由圖中可以看出,采用C18色譜柱對成分較為復雜的樣品的分離效果較差。前者在EGT色譜峰的對應位置還包含質荷比約為118.077、140.068、522.202、527.157和622.253的五個質譜雜質信號,后者在EGT色譜峰的對應位置還包含質荷比約為118.084和277.089的兩個質譜雜質信號。

圖9 C18柱檢測樣品3-14D-1的HPLC-MS譜圖Fig.9 HPLC-MS chromatograms of sample 3-14D-1 by C18 chromatographic column

圖10 C18柱檢測樣品FJ-009-254h的HPLC-MS譜圖Fig.10 HPLC-MS chromatograms of sample FJ-009-254h by C18 chromatographic column

2.3.3.2 對SB-Aq檢測方法的質譜驗證 由圖11、圖12可看出,與C18柱的檢測結果相比,SB-Aq柱對搖瓶發酵樣品的分離效果更佳,在257 nm下,EGT色譜峰與EGT質譜峰的保留時間基本一致,同時色譜峰的對應位置不包含其它雜質的質譜峰,說明了利用SB-Aq色譜柱分離得到的EGT色譜峰純度更高,對于發酵樣品中EGT的含量測定結果更準確。

圖11 SB-Aq色譜柱檢測樣品3-14D-1的HPLC-MS譜圖Fig.11 HPLC-MS chromatograms of sample 3-14D-1 by ZORBAX SB-Aq chromatographic column

圖12 SB-Aq色譜柱檢測樣品FJ-009-254h的得HPLC-MS譜圖Fig.12 HPLC-MS chromatograms of sample FJ-009-254h by SB-Aq chromatographic column

3 結論

本文建立的HPLC檢測方法能夠快速、簡便地檢測樣品中的EGT含量。所用流動相中只含體積比為1%的甲醇,對環境污染很小,EGT保留時間為6 min,對于雜質較多的發酵樣品,進行梯度洗脫程序的檢測時間也僅為38 min,建立的梯度洗脫程序可以清除雜質的積累,增強了方法的穩定性,延長了色譜柱的使用時間。經統計,檢測200個樣品之后,柱壓依然保持在初始狀態,且峰形、分離度均保持穩定良好水平。利用液質聯用證明了本方法適合于檢測成分較為復雜的發酵樣品中的EGT含量。該方法的線性、精密度、穩定性及加標回收率均滿足定量檢測的要求,可廣泛應用于各種EGT樣品的定量檢測。