BTH處理對采后草莓果實還原勢和抗病性的調控作用

2018-10-16 10:09:28伍冬志廖云霞汪開拓

食品工業科技 2018年18期

伍冬志,汪立,廖云霞,陳偲,汪開拓

(重慶三峽學院生命科學與工程學院,重慶 404100)

草莓(Fragaria×ananassa)為多年生薔薇科草莓屬草本植物,在全球各地均有廣泛種植,其果實具有外觀鮮艷、口感圓潤、酸甜可口及滋味豐富等優質食用特征,且富含維生素、酚酸、花色苷及其他各種微量元素,營養價值較高[1]。但因草莓果實糖酸含量高,內部組織柔軟多汁且無外皮屏障,故極易在貯運環節中受到病原真菌的侵染而發生大面積病害,造成嚴重損耗。B.cinerea是草莓果實中低溫貯運環節中最主要的病原菌[2];長期以來,施用化學殺菌劑可較好地控制B.cinerea在草莓果實表面的增殖,但多年連續使用化學殺菌劑可使病菌產生抗性,不僅降低了藥劑的防腐效果,還易導致嚴重的農藥殘留,直接危害人體健康并污染環境[3]。近年來的研究證實,茉莉酸及其甲酯、水楊酸、β-氨基丁酸、赤霉素或乙烯等綠色的植物內源激素類激發子可通過激活草莓、葡萄、楊梅和藍莓等多種漿果類果實自身防衛反應來抵御灰霉菌或青霉菌的侵染,從而有效減少化學藥劑用量,因此逐漸受到關注[4]。

眾多轉錄因子在植物防衛反應中發揮著重要作用[5]。研究表明,植物細胞內部的還原勢可直接決定轉錄因子的結構和功能:植物眾多轉錄因子通常以低活性的共聚體形式存在,但當植物受病菌脅迫或激發子誘導后,其細胞內的還原勢迅速升高,可將轉錄因子中的二硫鍵還原為巰基,進而產生大量轉錄因子的活性單體,隨后在核定位信號的作用下由細胞質進入細胞核中與病程相關(pathogensis-relatedproteins,PRs)基因特異性啟動子結合,最終激活PRs基因[6]。苯丙噻唑硫代乙酸甲酯(BTH)是非感光的功能性水楊酸類似物,可有效誘導水蜜桃[7]、葡萄[8]、香蕉[9]和芒果[10]等多種果實PRs基因的表達和植保素合成等抗病性反應,從而抑制病原菌侵染,但其中有關還原勢變化與誘導抗性之間的關聯仍不明確。實驗室前期研究已證實，0.1 mmol/L BTH處理可有效降低葡萄[8]和草莓果實[11]貯藏期間腐爛率,本研究以此為基礎,分析BTH處理對抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環、磷酸戊糖(PPP)途徑的影響以及抗病性的誘導作用,以期發現草莓果實還原勢和抗病性的消長規律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓果實(Fragaria×ananassacv. ‘Fengxiang’) 大小一致、轉色均勻并達到商業成熟度(八分熟),采摘于重慶市潼南區太安鎮有機草莓種植果園,隨后1 h內運回實驗場所,挑出尚有破損及病斑果實,剩下果實仔細排列在實驗桌上于室溫下自然風散去田間熱;BTH 美國Sigma-aldrich公司;谷胱甘肽還原酶(GR)活性測定試劑盒、GSH-POD活性測定試劑盒、NADP+/NADPH含量測定試劑盒、還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)含量測定試劑盒南京建成生物工程研究所;RNAprep Pure(多糖多酚植物總RNA提取)試劑盒天根生化公司;SuperScript II試劑盒美國Invitrogen公司;B.cinereaPers.:Fr菌株凍干粉中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCM)。

DW-86L338J型超低溫冰箱海爾公司;UV2600i紫外可見分光光度計日本島津公司;BSC-150恒溫恒濕培養箱上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;DYCP-31D型核酸電泳儀北京六一儀器廠;PTC-200型RT-PCR儀器、Gel Doc XR型凝膠成像儀美國伯樂公司;DW-86L338J型超低溫冰箱青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BTH處理和病原菌接種B.cinerea菌株凍干粉經活化并傳代培養7 d后(25 ℃),用無菌生理鹽水(內含0.02% Tween-80)提取孢子,用血球計數板調節懸浮液中孢子濃度至5×104個/mL。

用75%乙醇溶液對上述已散去田間熱的草莓果實進行表面消毒,隨后用無菌解剖針在果實直徑最大部位對稱穿刺2個孔(穿孔直徑2 mm,深度2 mm),再隨機分成四份:a. 對照組,用移液槍在草莓果實每個穿刺部位注入10 μL的無菌蒸餾水;b.B.cinerea接種組,用移液槍在草莓果實每個穿刺部位注入10 μL 5×104個/mL的B.cinerea孢子懸浮液;c. BTH處理組,用移液槍在草莓果實每個穿刺部位中注入10 μL 0.1 mmol/L的BTH溶液;d. BTH+B.cinerea接種組,草莓果實每個穿刺部位中先注入10 μL 0.1 mmol/L的BTH溶液,于20 ℃下貯藏 6 h后，再在各穿刺部位接種10 μL 5×104個/mL的B.cinerea孢子懸浮液。

以上操作溫度控制在(20±1) ℃。各處理完成后,將草莓果實每8個分裝于一個聚乙烯塑料盒中,在(20±1) ℃、90%±5% RH下貯藏5 d。每天觀察果實灰霉病發病狀況,并取健康果肉組織在液氮中速凍,-80 ℃下保存備用。各處理包含240顆果實,重復3次,整個實驗重復2次。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 發病率和病斑直徑發病率(%)=(穿刺處出現霉菌性病害果實數/總果實數)×100;病斑直徑用游標卡尺直接進行測量。

1.2.2.2 G6PDH和6PGDH活性的測定稱取2 g果實凍樣,加入10 mL內含30 mmol/L甘露醇、5 mmol/L MgSO4、5 mmol/L KCl和1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.2)仔細冰浴勻漿,再以5000×g離心10 min(4 ℃)后取上清液測定酶活性。G6PDH和6PGDH活性參照indelá等[12]的方法進行測定,以反應液中每分鐘生成1 nmol NADPH為1個酶活力單位,以U/mg蛋白表示結果。

1.2.2.3 脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性的測定稱取2 g果實凍樣,加入10 mL 內含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L AsA和1%交聯聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的50 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)仔細冰浴勻漿,再以5000×g離心10 min(4 ℃)后取上清液測定酶活性。參考Shigenaga等[13]方法測定DHAR和MDHAR活性,以反應液在340 nm處吸光值每分鐘上升0.001為1個DHAR酶活性單位,以反應液在265 nm處吸光值每分鐘上升0.001為1個DHAR酶活力單位,以U/mg蛋白表示結果。

1.2.2.4 谷胱甘肽還原酶(GR)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定稱取2 g果實凍樣,加入7 mL內含2 mmol/L EDTA和2 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.2)仔細冰浴勻漿,再以5000×g離心10 min(4 ℃)后取上清液測定酶活性。參考Cai等[14]方法用試劑盒測定GR(GSH還原法)活性;參考Xu等[15]方法測定APX活性,以反應液在290 nm處吸光值每分鐘下降0.001為1個APX酶活性單位,結果以U/mg蛋白表示。

1.2.2.5 AsA和DHA、NADPH和NADP+以及GSH和GSSG含量的測定 AsA和DHA含量參考Kampfenkel等[16]方法進行測定;NADPH和NADP+參考Nagano等[17]的硫酸甲酯吩嗪反應法進行測定(試劑盒法);GSH和GSSG參考Rahman等[18]的酶循環法,利用5,5′-二硫硝基苯甲酸反應進行測定(試劑盒法)。

1.2.2.6PRs基因表達豐度的測定取1 g果實凍樣使用適合多糖多酚類樣品RNA提取的RNAprep Pure試劑盒進行果實RNA的提取(4 ℃)。取1 mg RNA采取SuperScript II試劑盒逆轉錄cDNA第一鏈,Oligo(dT)為引物。用Premier 7.0軟件設計相關基因特異性引物(表1)。以草莓18S rRNA基因為內參。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離,經EB染色后，用凝膠成像儀掃描并定量分析[19]。

表1 草莓PRs基因特異性引物序列Table 1 Sequence of primers used for PRs genes in strawberries

1.3 數據分析

果實發病率和病斑直徑重復測定5次,其余指標均重復測定3次。采取Duncan氏多重比較法進行差異顯著性檢驗(SPSS 13.0),0.05和0.01分別表示顯著和極顯著差異水平。

2 結果與分析

2.1 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實灰霉病的影響

由圖1可知,草莓果實在20 ℃貯藏時發病率及病斑直徑逐漸上升,至貯藏結束時,對照果實發病率達到39.8%,病斑直徑達3.72 mm;單一BTH處理有效抑制了果實腐爛的發生,貯藏5 d后果實發病率和病斑直徑分別較對照果實下降了56.3%和39.3%。接種病原菌B.cinerea后,草莓果實灰霉病癥狀急劇發展,貯藏5 d后果實發病率達到65.8%,病斑直徑達4.66 mm;BTH顯著抑制了果實貯藏期間由B.cinerea導致的灰霉病的發生(p<0.05),貯藏結束時果實發病率和病斑直徑分別較單一B.cinerea接種果實下降了74.2%和41.4%。

圖1 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實灰霉病發病率(A)和病斑直徑(B)的影響Fig.1 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on disease incidence(A)and lesion diameter(B)in strawberries during the storage for 5 days注:不同字母表示存在顯著性差異(p<0.05)。

2.2 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間磷酸戊糖途徑關鍵酶活性的影響

由圖2可得,對照組草莓果實在20 ℃貯藏期間,其G6PDH活性在貯藏前3 d逐漸上升,隨后迅速下降;6PGDH活性則呈逐漸下降趨勢。相比于對照果實,B.cinerea接種顯著降低了G6PDH和6PGDH活性(p<0.05);而BTH處理則顯著誘導了G6PDH和6PGDH活性的上升(p<0.05),使G6PDH活性在整個貯藏期間以及6PGDH活性在貯藏后期均高于對照。經BTH處理并接種病原菌的果實中G6PDH和6PGDH活性急劇上升,在整個貯藏期間均顯著高于單一BTH處理果實(p<0.05)。

圖2 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實G6PDH(A)和6PGDH(B)活性的影響Fig.2 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on activities of G6PDH(A)and 6PGDH(B) in strawberries during the storage for 5 days

2.3 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間AsA-GSH循環關鍵酶活性的影響

由圖3可知,對照草莓果實中MDHAR、DHAR、GR和APX活性均隨貯藏時間的延長而呈緩慢下降趨勢,經單一B.cinerea接種的果實中，MDHAR、DHAR和APX活性在整個貯藏期間緩慢下降(p<0.05),GR活性則在貯藏前4 d顯著低于對照果實(p<0.05)。BTH處理可延緩這四種AsA-GSH循環關鍵酶在貯藏期間活性的下降,使四種酶活性在整個貯藏期間均顯著高于對照水平(p<0.05)。BTH+B.cinerea接種處理較單一BTH處理更為顯著地誘導了GR和APX活性的上升(p<0.05),同時促使果實DHAR活性在貯藏后2 d顯著高于單一BTH處理(p<0.05);此外,經BTH+B.cinerea接種果實中MDHAR活性與經單一BTH處理果實相比無顯著差異(p>0.05)。

圖3 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間MDHAR(A)、DHAR(B)、GR(C)和APX(D)活性的影響Fig.3 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on activities of MDHAR(A)、DHAR(B)、GR(C)and APX(D)in strawberries during the storage for 5 days

2.4 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間NADPH和NADP+含量的影響

由圖4所示,對照草莓果實NADPH含量在貯藏前3 d緩慢上升,隨后逐漸下降;NADP+含量則在貯藏期間逐漸上升。經單一B.cinerea接種的果實中NADPH在貯藏第1 d出現明顯上升,隨后急劇下降并顯著低于對照水平(p<0.05);同時,B.cinerea接種促進了果實中NADP+的積累,使其在整個貯藏期間均顯著高于對照果實(p<0.05)。除貯藏第3 d外,BTH處理在這個貯藏期間均顯著誘導了果實中NADPH合成并降低了NADP+含量(p<0.05),而BTH+B.cinerea接種處理則較單一BTH處理更為顯著提高了NADPH含量并降低了NADP+含量(p<0.05)。

圖4 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間NADPH(A)和NADP+(B)含量的影響Fig.4 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on contents of NADPH(A)and NADP+(B) in strawberries during the storage period

2.5 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間GSH、GSSG、AsA和DHA含量的影響

如圖5可得,對照草莓果實中GSH含量在貯藏期間基本維持穩定,GSSG和DHA含量則呈現緩慢上升趨勢,AsA含量在貯藏第1 d出現峰值,隨后逐漸下降。經單一B.cinerea接種的果實中GSH和AsA含量在整個貯藏期間顯著低于對照果實(p<0.05);同時,B.cinerea侵染在5 d的貯藏周期內均能顯著促進果實中GSSG和DHA含量的上升(p<0.05),其中GSSG含量在貯藏期間顯著高于對照果實(p<0.05),而DHA則僅在貯藏前4 d顯著高于對照果實(p<0.05)。單一BTH處理和BTH+B.cinerea接種處理均能有效增加GSH和AsA含量，并抑制GSSG和DHA含量的上升,經BTH+B.cinerea接種處理的果實中GSH在貯藏后期(3～5 d)顯著高于經單一BTH處理的果實(p<0.05)。

圖5 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間GSH(A)、GSSG(B)、AsA(C)和DHA(D)含量的影響Fig.5 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on contents of GSH(A),GSSG(B),AsA(C)and DHA(D)in strawberries during the storage period

2.6 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間PRs基因表達豐度的影響

由圖6可知,經單一B.cinerea接種的草莓果實PRs基因表達豐度在貯藏第1 d出現明顯峰值,其數值分別是對照水平的1.67、3.89、1.56和1.65倍,隨后迅速下降至對照水平。經單一BTH處理的草莓果實中PRs基因表達豐度在貯藏第1 d與對照相比無顯著差異(p>0.05);但在貯藏第4、5 d,單一BTH處理顯著誘導了果實PRs基因表達,使其豐度顯著(p<0.05)高于對照果實。BTH復合B.cinerea接種較單一B.cinerea接種或BTH處理更能促進草莓果實PRs基因的表達豐度的提高,使果實中FaPR1、FaPR5、FaCHI-1和Faβglu基因表達豐度整個貯藏期間均顯著(p<0.05)高于單一B.cinerea接種或BTH處理果實。

圖6 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間FaPR1(A)、FaPR5(B)、FaCHI-1(C)和Faβglu(D)基因表達豐度的影響Fig.6 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on gene expression levels of FaPR1(A),FaPR5(B),FaCHI-1(C)and Faβglu(D)in strawberries during the storage period

3 討論

與水楊酸(SA)的作用模式類似,BTH也被認為是一種高效激發子可直接激活植物超敏反應以形成SAR抗性[20]。最新研究表明,低濃度BTH處理誘導的植物Priming反應可在病原菌侵入時啟動活性氧迸發、植保素合成以及PRs基因表達等一系列抗病性反應[21],以使植物免遭病原菌侵害。本研究經0.1 mmol/L BTH處理后,草莓果實中FaPR1、FaPR5、FaCHI-1和Faβglu等PRs基因表達量在貯藏前期無顯著升高,貯藏后期草莓發病率逐漸上升,基因表達豐度也顯著增加。果實先經BTH處理再接種病原菌B.cinerea后,其PRs基因豐度立即顯著增加(p<0.05)并持續維持在較高水平。這說明，0.1 mmol/L BTH誘導的草莓果實抗病性反應是一種典型的Priming反應模式;通過該抗性模式,草莓果實可在遭受B.cinerea侵染時迅速啟動防衛反應,激活PRs基因,從而控制灰霉病癥狀的進一步發展。這與前期研究結果類似,低濃度的BTH處理(0.01或0.1 mmol/L)可誘導葡萄果實的Priming反應,從而使果實在接種病原菌后迅速展現抗性[8]。

在誘導抗性網絡中,提高植物內部還原勢是激活植物防衛反應的重要步驟。對擬南芥WRKYs、GIPs和NPRs等轉錄因子的研究表明,在植物未受到病原菌侵染或激發子處理時,植物細胞中還原勢較低,轉錄因子多以二硫鍵鍵合為共聚體的無活性形式存在;但當植物受到病原菌侵染開始啟動防衛反應時,植物細胞內還原勢急劇上升,從而將轉錄因子共聚體中的二硫鍵還原為巰基,釋出具有活性的轉錄因子單體,最終誘導下游PRs基因的表達[22-24]。NADPH、GSH和AsA是植物細胞中主要的還原性物質,其含量的高低直接決定還原勢[25]。PPP途徑是植物糖代謝支路,其可將NADP+還原為NADPH,G6PDH和6PGDH是該途徑的限速酶類[26];AsA-GSH循環可將GSSG和DHA還原為GSH和AsA,MDHAR、DHAR、GR和APX是該途徑的關鍵酶類[27]。PR1基因是植物抗病性反應的特定標記基因,可直接反映防衛反應水平的高低;FaPR5基因是草莓與抗病相關的類甜蛋白的編碼基因;FaCHI-1和Faβglu基因經表達后可合成幾丁質酶和葡聚糖酶,水解真菌細胞壁[28]。在本研究中,B.cinerea侵染顯著抑制了草莓果實PPP途徑關鍵酶G6PDH和6PGDH活性以及AsA-GSH循環關鍵酶MDHAR、DHAR、GR和APX活性,從而導致還原性物質NAPDH、GSH和AsA逐漸氧化為NADP+、GSSG和DHA,同時果實中FaPR1、FaPR5、FaCHI-1和Faβglu基因表達豐度也顯著下降。這說明草莓果實灰霉病的發展與果實內部還原勢的降低密切相關;BTH可有效誘導草莓果實PPP途徑和AsA-GSH循環關鍵酶活性的上升,提升NAPDH、GSH和AsA含量,提高果實還原勢從而促進PRs基因表達,最終降低果實發病率。