1-MCP處理對采后桃果實糖代謝的影響

韓 帥,蔡洪芳,馬瑞娟,俞明亮,郁志芳,*

(1.南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095;2.江蘇省農業科學院園藝研究所,江蘇南京 210014)

桃(Prunuspersica)屬于薔薇科李屬植物,原產中國,歷史悠久[1]。桃果實因其豐富的營養物質及獨特的風味,受到廣大消費者的青睞。果實中糖的種類及含量不僅決定了果實的風味,而且還是重要的能源物質。糖是眾多代謝通路的中間產物及原料,糖代謝及其信號轉導參與調控植物的發育、成熟和衰老等多個過程[2]。桃果實中的主要可溶性糖包括蔗糖、果糖和葡萄糖,且蔗糖占主導地位[3]。但桃是典型的呼吸躍變型果實,采后易成熟衰老,不耐貯藏,影響其商品價值[4]。近年來,各種各樣的物理、化學和生物保鮮技術被廣泛研究,如氣調保藏、化學保鮮劑(1-甲基環丙烯(1-MCP)、茉莉酸、水楊酸等)、拮抗菌保鮮等,其中屬于化學保鮮的乙烯抑制劑因其無毒安全性高、環境友好、操作簡便、作用顯著得到了行業的普遍關注與認可。

1-MCP是一種新型的乙烯抑制劑,具有無毒、高效的優點,能夠與乙烯受體蛋白優先發生不可逆的結合,阻止乙烯和其受體的結合，從而導致乙烯信號轉導受阻[5]。研究表明，1-MCP能夠有效地延緩多種果實的成熟和衰老,特別對于呼吸躍變型果實其保鮮效果更顯著[6]。Shen等[7]研究表明,1-MCP可以顯著減緩木瓜的軟化及顏色變化;Zhang等[8]研究發現，1-MCP處理可以降低棗果實的呼吸速率和乙烯生成量,延緩棗果實硬度、總酸和可溶性固形物的下降,保持了更高的品質。也有研究表明,1-MCP處理雖然可以推遲果實衰老,延長貨架期,但會顯著性地減少芳香物質的產量[9]。金宏[10]研究表明,1-MCP雖然可以顯著延緩和保持蘋果果實的成熟衰老和保鮮期,但抑制了果實AAT的活性,顯著降低了果實芳香酯香味物質的含量。

目前,研究者多側重研究果實發育過程中糖代謝與糖組分的關系及采后處理對糖含量的影響,鮮有從分子水平上研究1-MCP處理對桃果實糖含量的調控機制。為進一步了解1-MCP對桃果實糖代謝的調控機制,本文借助RNA-seq和代謝物分析手段,從代謝與轉錄水平上探討1-MCP對貯藏期間桃果實糖代謝的影響,以期為進一步研究糖代謝調控技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“霞暉6號”桃果實 2017年7月9號采摘于江蘇省常州市水蜜桃科技示范園,采摘后立即運回實驗室,20 ℃下充分散去田間熱后,選擇大小均一、無機械傷、無病蟲害且成熟度一致的果實隨機分成兩組(每組150個果實)以待處理。

FHM-5硬度計 Takemura Electric Works Ltd.;KQ-300DB數控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;恒溫磁力攪拌器 常州國華電器有限公司;TGL16M 高速冷凍離心機 長沙維爾康湘鷹離心機有限公司;微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;超低溫冰箱 中科美菱有限公司;CO2分析儀 PBI Dansensor Ltd.;Bruker氣質聯用儀 美國布魯克公司;植物提取試劑盒 寶日醫生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 根據先前本實驗室的研究結果[11],一組桃果實置于密閉的泡沫箱,用10 μL·L-1的1-MCP在(20±0.5) ℃、相對濕度85%～90%條件下處理12 h(1-MCP),為了避免CO2的積累,處理的同時，在泡沫箱里放入1%的KOH溶液，吸收多余的CO2,以放置密閉泡沫箱無任何處理的另一組為對照組(CK)。每個處理有50個果實,并重復3次。處理完成后將果實放置在(20±0.5) ℃條件下貯藏7 d,分別在第0、1、3、5、7 d測量果實的生理指標,并分別從每個取樣時間點的30個果實均勻取中果皮果肉,混合均勻,用液氮冷凍后置于-80 ℃下保存以待后續分析。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 硬度的測定 采用硬度計進行測定,采用直徑為8 mm的探頭,以1 mm·s-1的速度測量去皮后的桃果實硬度,每個果實測量赤道對立面2次,重復取果10個,取平均值。

1.2.2.2 呼吸強度的測定 采用CO2分析儀測定。將3～4個已稱重的果實放入一個密閉容器內,在室溫條件下放置1 h后連接儀器進行測量并記錄CO2的讀數A,每組重復3次。計算公式為CO2(mg·h-1·kg-1FW)=A×104×1.96×L×10-3×T-1×FW-1。

A:儀器讀取的數值,百分含量%;L:密閉容器的體積,單位為L;T:放置的時間,單位為h;FW:桃果實的重量,單位為kg。

1.2.2.3 糖含量的測定 樣品的提取和衍生化參照Zhang[12]的方法并稍作修改。隨機稱取桃組織300 mg放于研缽中,加入液氮充分研磨后，轉移至離心管中,并加入2.7 mL甲醇和0.3 mL的內標核糖醇(0.2 mg·mL-1),渦旋振蕩2 min后，置于4 ℃的超聲清洗儀中超聲提取15 min,然后70 ℃水浴中提取15 min,4 ℃,8000 r/min離心10 min,上清液過0.45 μm膜后，吸取100 mL于氮吹儀上吹干。吹干后的樣品加入80 μL 15 mg·mL-1的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液,37 ℃的振蕩培養箱中肟化反應90 min,之后加入80 μL BSTFA+1% TMCS于70 ℃水浴反應60 min,室溫靜置以待上樣。

氣相質譜聯用儀的參數如下[12]:采用HP-5M毛細管柱,高純氦氣作為載氣,流速為1 mL·min-1,進樣口溫度為250 ℃,分流比10∶1;柱溫箱升溫程序為:90 ℃,保持0.2 min,以10 ℃ min-1升至160 ℃,以5 ℃ min-1升至220 ℃,20 ℃ min-1升至280 ℃保持16 min;檢測器離子源溫度220 ℃,電子能量70 EV,質量掃描范圍為45～600 m/z。

1.2.2.4 果實總RNA的提取及RNA-seq 果實總RNA的提取參照植物總RNA提取試劑盒說明書進行,并用微量紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量及完整性。RNA檢測合格后送至華大基因科技有限公司，使用Illumina HiSeq平臺測序,使用Bowtie2[13]將clean reads比對到參考序列已統計基因比對率,之后再使用RSEM[14]計算基因的表達水平。

1.3 數據分析

每個實驗組重復三次,結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 18.0軟件,以鄧肯氏多重比較的方法，對組間數據進行顯著性分析(p<0.05),采用Microsofr excel繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 硬度的變化

硬度是衡量果實成熟度及品質的重要指標。圖1顯示了1-MCP處理對貯藏期間桃果實硬度的影響。隨貯藏時間延長,果實硬度也逐漸下降。對照組硬度從最初的15.3N降到3.5N,下降了77.1%;1-MCP處理組只下降了72.5%;整個貯藏期間,1-MCP處理都顯著地延緩了桃果實硬度的下降(p<0.05)。結果表明,1-MCP能夠有效地維持桃果實的硬度。

圖1 1-MCP對貯藏期間桃果實硬度的影響Fig.1 Effect of 1-MCP on firmness of peach fruit during storage

2.2 呼吸速率的變化

呼吸作用是采后果實重要的生理活動,其速率的測量可以反應桃果實的生理狀態和貯藏效果[15]。圖2的1-MCP對貯藏期間桃果實呼吸速率的影響顯示,對照組果實呼吸速率前5 d直線上升,第5 d達到最大值后下降;處理組果實呼吸速率呈現了先下降后上升的變化趨勢,1-MCP處理不僅顯著降低了貯藏期間桃果實的呼吸速率(p<0.05)，而且還推遲了呼吸高峰的時間。以上結果表明，1-MCP可延緩桃果實成熟衰老進程,延長桃果實的保鮮期。

圖2 1-MCP對貯藏期間桃果實呼吸速率的影響Fig.2 Effect of 1-MCP on respiration rate of peach fruit during storage

2.3 糖含量的變化

研究認為,桃果實中可溶性糖主要有葡萄糖、果糖和蔗糖[16-17]。圖3顯示,桃果實中的主要可溶性糖為蔗糖,這于Yu[18]和黃麗萍[19]的研究結果一致,但與甜瓜[20]、柿子[21]和蘋果[22]等果實情況不同。由圖3A、B可看出,兩處理桃果實的葡萄糖和果糖在整個貯藏期間，呈現持續穩定的遞增趨勢,且在貯藏的中期(第5 d)，1-MCP 處理的果實葡萄糖和果糖均顯著低于對照(p<0.05);由圖3C可知,蔗糖含量變化趨勢與兩種己糖含量變化趨勢相反,貯藏前中期(第1和5 d)，1-MCP處理組的蔗糖含量顯著高于對照果實(p<0.05),即使在第7 d 1-MCP處理果實的蔗糖含量還是高于對照。以上結果,提示1-MCP可降低蔗糖分解的速度,從而減慢了果糖和葡萄糖的增加。Singh等[23]研究表明,NO處理能夠保持梨果實更高的蔗糖含量,延緩果實的衰老。由此得出,1-MCP處理可以延緩貯藏期桃果實蔗糖含量的降解,保持更高的蔗糖含量,為桃果實延長貯藏期奠定物質基礎。

圖3 1-MCP對貯藏期間桃果實可溶性糖的影響Fig.3 Effect of 1-MCP on solublesugars of peach during storage

2.4 糖代謝酶相關基因表達

為在轉錄水平上研究1-MCP對桃果實糖代謝的調控機制,通過薔薇科基因組數據庫(www.rosaceae.org,GDR)搜索相關酶基因，并在轉錄組數據中篩選,共得到表1中14個基因成員,其中有4個SPS基因、3個SS基因,6個NI基因和1個AI基因。

表1 蔗糖代謝相關酶基因的注釋Table 1 Annotation of sugar metabolism related genes

2.4.1 PpSPS基因的變化 貯藏前5 d,1-MCP處理下調了相同時間點桃果實中PpSPS2、PpSPS3表達量,同時下調了第5 dPpSPS1的轉錄水平，顯著上調了PpSPS1、PpSPS2和PpSPS3第7 d基因表達量(p<0.05);不同于PpSPS1、PpSPS2、PpSPS3,整個貯藏期間1-MCP顯著上調了PpSPS4表達量(p<0.05)(圖4)。PpSPS1、PpSPS2的變化趨勢與果實呼吸速率保持一致,表明PpSPS1、PpSPS2的表達可能與果實的呼吸代謝有關。相較于對照組,1-MCP處理組PpSPS4整個貯藏期間都保持了較高的轉錄水平,聯想到1-MCP主要阻斷乙烯的合成并影響其相關轉錄因子,推測PpSPS4可能受到某一轉錄因子的調控,這還需進一步的驗證。以上結果表明,1-MCP可以上調PpSPS表達,為保持更高的蔗糖含量奠定了基礎。

圖4 1-MCP對貯藏期間桃果實SPS基因表達的影響Fig.4 Effect of 1-MCP on SPS genes expression of peach注：FPKM:Fragment perkilobase permillion mapped fragments,每百萬個fragments中比對上某一轉錄本每千堿基長度的fragments數目。圖5～圖7同。

2.4.2PpSS基因的變化 圖5顯示,貯藏期間桃果實主要表達了PpSS1、PpSS2和PpSS3。其中PpSS1的表達水平最高,PpSS3表達量最少。1-MCP處理下調了貯藏期間PpSS1的表達水平;上調了貯藏末期PpSS2的表達水平;對照組PpSS3表達量第5 d迅速增高,隨后迅速下降,而1-MCP處理組呈現了逐漸下降的趨勢,并在第5、7 d分別顯著低于和高于對照組的表達量(p<0.05)。

圖5 1-MCP對貯藏期間桃果實SS基因表達的影響Fig.5 Effect of 1-MCP on SS genes expression of peach

已有研究表明[24],SS主要參與蔗糖的水解方向,進而推測1-MCP可以通過下調PpSS1的表達水平減緩蔗糖的水解,保持更高的蔗糖含量。

2.4.3PpNI和PpAI基因的變化 圖6～圖7顯示,在7個水解酶基因中,NI基因的表達量顯著高于AI的表達量。從圖6中可得,PpNI1的表達量相對穩定，且在兩組之間無顯著差異(p>0.05),PpNI2的表達量整體變化不大。1-MCP處理可以顯著增強PpNI6第3 d和PpNI5第7 d的表達量(p<0.05)。在整個貯藏中期(第3、5 d),1-MCP顯著地下調了PpNI3、PpNI4的表達量(p<0.05)。由圖7可知,1-MCP能夠下調PpAI1在第3、7 d的表達量,但是在整個貯藏期間,PpAI的轉錄水平都偏低。以上結果說明,1-MCP主要通過抑制NI的轉錄水平來調控桃果實的糖代謝。

圖6 1-MCP對貯藏期間桃果實NI基因表達的影響Fig.6 Effect of 1-MCP on NI genes expression of peach

圖7 1-MCP對貯藏期間桃果實AI基因表達的影響Fig.7 Effect of 1-MCP on AIgenes expression of peach

3 討論

1-MCP作為一種新型乙烯受體抑制劑,可阻斷乙烯所誘導的信號轉導,延緩乙烯的生理反應[25]。果實的糖代謝與積累不僅決定了果實的風味和品質,而且糖作為信號分子可參與信號轉導調節植物的生長發育及基因表達[26-27]。已有研究表明,采后處理能夠影響果實的糖代謝。Sun[28]等研究表明,采后一氧化氮處理能夠保持桃果實的蔗糖含量,延緩桃果實的成熟衰老。本實驗中,1-MCP處理能夠推遲并降低果實的呼吸高峰,維持更高的硬度和蔗糖水平,表明桃果實的生理狀態與果實的品質具有一定的相關性。

隨著桃基因組的測序完成,越來越多的研究者開始從轉錄水平上探討采后處理的調控機理。Yu[18]等研究顯示,HA和MeJA處理可以通過上調蔗糖磷酸合成酶的基因表達和降低酸性轉化酶的活性，來保持低溫貯藏期間桃果實的蔗糖含量。在本實驗中,1-MCP處理顯著提高了貯藏末期(第7 d)PpSPS1、PpSPS2、PpSPS3的轉錄水平和貯藏期PpSPS4的轉錄水平(p<0.05);顯著抑制了第5 d的PpSS1、PpSS3和貯藏中期(3、5 d)PpNI3、PpNI4的表達量(p<0.05)。雖然兩組間PpAI有顯著性差異,但其表達量過低。

4 結論

1-MCP處理保持了桃果實更高的硬度，降低了桃果實的呼吸速率，并推遲了呼吸高峰的到來；1-MCP處理使桃果實維持了更高的蔗糖含量和較低的已糖含量，減緩了蔗糖的降解；1-MCP上調了桃貯藏期間PpSPS4和貯藏末期PpSPS1、PpSPS2、PpSPS3的基因表達和下調中性轉化酶PpNI3、PpNI4和蔗糖合成酶PpSS1的基因表達,進而保持了貯藏期高的蔗糖含量和低的葡萄糖和果糖含量。