基于紅外光譜指紋圖譜的當歸快速鑒別△

李小陽，宮源，裴紋萱，董玲，孫裕，宋學斌，陳建波*，王晶娟*

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.黑龍江省肇東市第一中學，黑龍江 肇東 151100；3.北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 100029；4.蘭州佛慈制藥股份有限公司，甘肅 蘭州 730046)

中藥當歸是傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根，性溫，味甘、辛，歸肝、心、脾經，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便之功效[1]。作為傳統的藥食兩用品種，當歸產銷量大，價格較高，而且經常出現熏硫加工、摻假混偽、以次充好等問題。因此，建立當歸全程質量控制方法，對于保證當歸在藥用或者食用時的有效性和安全性是非常必要的。

根據現行《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)規定，當歸的鑒定和質量評價指標主要分為形性指標和化學指標兩部分。其中，形性指標包括性狀、切片和粉末顯微結構，化學指標包括對照藥材、阿魏酸、藁本內酯定性檢測(薄層色譜)、揮發油含量測定、阿魏酸含量測定[1]。形性指標的檢查過程相對簡便、快速，但是這些方法比較依賴于操作者的知識和經驗，主觀因素影響較大，難以嚴格規范。化學指標相對客觀、量化，容易規范，但是檢查過程需要的時間和成本也較高。而且，現有的薄層色譜、液相色譜和揮發油測定只能反映當歸的部分化學成分信息，對于很多其他成分缺少控制。因此，建立一種客觀、量化、簡便、快速的整體成分檢測方法，作為現有形性指標和化學指標的補充，既可以更加全面地對當歸質量進行評價，又可以提供高通量、低成本的快速檢測手段，對于實現當歸的全程質量控制是非常有意義的。

大量研究表明，紅外光譜可以作為一種有效的中藥整體化學成分快速檢測方法[2-9]。紅外光譜測試對樣品的前處理要求非常簡單，絕大部分中藥樣品可以直接或者粉碎后進行測試，不需要使用有機溶劑進行分離提取。因此，紅外光譜作為指紋圖譜能夠全面反映中藥樣品整體化學成分，而且具有簡便快速、綠色低廉的優勢。已有報道表明，使用紅外光譜對當歸的化學成分進行表征、對當歸及其相似物種進行區分是可能的[10-14]。因此，本研究擬通過建立當歸藥材的紅外光譜指紋圖譜及其相似度評價指標，提供一種簡便、客觀、量化、反映整體成分信息的當歸質量快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

當歸藥材分別于2015年和2016年采集自甘肅岷縣(19批次)、渭源縣(20批次)和漳縣(20批次)，經北京中醫藥大學中藥學院王晶娟副教授鑒定為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根。兩個熏硫當歸樣品來自藥材市場。川芎、獨活、羌活、前胡為購自中國食品藥品檢定研究院的對照藥材。中藥樣品粉碎后過60目篩，粉末直接進行紅外光譜測試。分析純蔗糖和溴化鉀(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 紅外光譜測試

紅外光譜測試所用儀器為PerkinElmer Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀，DTGS檢測器，溴化鉀壓片法獲得樣品粉末的透射紅外光譜。光譜測量范圍4000400 cm-1，分辨率4 cm-1，每張光譜累加掃描16次，使用空氣作為光譜背景，掃描過程中自動扣除水蒸氣和二氧化碳干擾。

1.3 數據處理

樣品原始測量光譜經過PerkinElmer Spectrum v10軟件的自動基線校正和歸一化處理后進行譜圖分析。使用MATLAB v7.0軟件計算樣品紅外光譜的相關系數并進行統計分析。紅外光譜的相關系數使用ASTM規定的夾角余弦方程式(1)定義[15]，即：

(1)

式中：Rij為光譜i與光譜j之間的相關系數，xik與xjk分別是光譜i與光譜j在波數k處的吸光度，n是所選擇光譜區域內波數變量數目。

2 結果與討論

2.1 當歸藥材紅外光譜整體特征分析

圖1所示為甘肅岷縣、渭源縣和漳縣所產不同批次當歸藥材的平均紅外光譜。3個產地的當歸藥材紅外光譜特征比較一致，主要包括：3600～3000 cm-1區域的羥基O-H伸縮振動吸收峰、3000～2800 cm-1區域的C-H伸縮振動吸收峰、1750 cm-1附近的羰基C=O伸縮振動吸收峰、1640 cm-1附近的復雜疊加峰(蛋白質酰胺I帶、羥基O-H彎曲振動吸收峰、芳環骨架振動吸收峰等)、1300～900 cm-1區域的復雜疊加峰(C-O伸縮振動峰、O-H彎曲振動峰、糖環骨架振動峰等)。可以看到，除了1800～1400 cm-1區域，當歸藥材紅外光譜與結晶態蔗糖非常相似，說明當歸藥材中含有大量的結晶態蔗糖。

注：a.岷縣當歸平均光譜；b.漳縣當歸平均光譜；c.渭源縣當歸平均光譜；d.蔗糖。圖1 不同產地當歸平均紅外光譜

2.2 當歸藥材對照光譜與相關系數閾值計算

性狀鑒定中發現，2016年漳縣所產當歸中有3個批次的樣品異常，全歸整體細小，表面黑棕色，質地硬。后續紅外光譜分析也發現，這3個批次的當歸樣品與其他樣品有顯著差異，因此將其標記為異常當歸樣品。其余56批次的當歸樣品沒有顯著的性狀或者光譜異常，均作為校正集樣品使用。

鑒于中藥材天然存在的成分波動性，將全部校正集當歸樣品的平均光譜作為當歸藥材對照光譜。然后，逐個計算校正集樣品光譜與對照光譜的相關系數并進行統計分析，得到顯著性水平為0.05時的相關系數分布下限，即為正常當歸藥材的相關系數識別閾值。如果待測樣本與當歸對照光譜的相關系數高于識別閾值，則認為該待測樣本是正常當歸藥材；反之，認為該待測樣本不是當歸或者是異常當歸藥材。需要注意的是，光譜相關系數的最大值是1、最小值是0，因此對相關系數分布區間進行統計分析時，應該使用beta分布函數進行擬合。見圖2。

注：A.1800～800 cm-1；B. 1800～1200 cm-1； C.1200～800 cm-1。圖2 不同波段校正集當歸樣本紅外光譜相似度分析

注：A.1800～800 cm-1；B. 1800～1200 cm-1；C.1200～800 cm-1。圖3 不同波段相關系數閥值

由于紅外光譜的不同波段所反映的化學成分信息具有一定差異，建立中藥材的紅外光譜指紋圖譜與相似度評價指標時需要選擇合適的光譜區域。原則上，作為指紋圖譜所使用的光譜區域應該盡可能寬，以覆蓋盡可能多的化學信息。但是，有些光譜區域對于樣品識別沒有顯著意義甚至引入干擾，應該予以排除。對于大部分中藥材來說，1800～800 cm-1區域的紅外光譜基本可以滿足作為指紋圖譜的需求。如果需要特別關注某部分化學信息，可以將光譜區域進一步縮小或進行組合。對于當歸藥材來說，1800～800 cm-1區域反映了整體化學信息，1200～800 cm-1區域主要反映了蔗糖信息，而1800～1200 cm-1區域主要反映了蔗糖以外的其他成分信息。因此，本研究選擇上述3個波段分別建立當歸藥材的相關系數識別閾值(結果如圖3所示)，所有波段的相似度同時滿足要求才認為是正常的當歸藥材，以提高當歸藥材紅外光譜指紋圖譜相似度評價方法的特異性。使用上述3個波段的相關系數識別閾值對校正集樣品進行檢查，所有樣品均正常，說明該方法具有很好的靈敏度。

2.3 異常當歸樣品的識別與分析

如圖4所示，上面建立的多波段當歸藥材紅外光譜指紋圖譜相似度指標，可以有效識別出異常當歸藥材與傘形科其他藥材。需要注意的是，僅使用1800～800 cm-1區域的紅外光譜，無法發現熏硫當歸、川芎、獨活與正常當歸藥材的差異；僅使用1200～800 cm-1區域的紅外光譜，無法發現部分熏硫當歸、川芎與正常當歸藥材的差異。這說明，使用多個波段建立當歸藥材紅外光譜指紋圖譜相似度指標，確實可以有效提高該評價方法的特異性。

注：A.1800～800 cm-1；B.1800～1200 cm-1；C.1200～800 cm-1。圖4 不同波段異常當歸樣本紅外光譜相似度分析

圖5所示為當歸藥材對照紅外光譜與2016年漳縣所產3個批次異常當歸樣品的紅外光譜。相比于對照光譜，異常當歸樣品的主要差異在于1200～800 cm-1區域的吸收峰強度下降，而且吸收峰形狀明顯不同，說明其中結晶態蔗糖含量較少。這些異常樣品可能是生長發育不良，或者遭受了某些外界傷害，導致糖類成分積累異常。

注：A.當歸對照光譜；B.異常當歸樣本1；C.異常當歸樣本2；D.異常當歸樣本3。圖5 異常當歸樣本紅外光譜分析

圖6所示為當歸藥材對照紅外光譜與兩個熏硫樣本的吸收峰形狀，與當歸藥材相比，熏硫樣本在1200～800 cm-1區域的吸收峰形狀也有所改變，說明硫熏對當歸藥材的成分影響比較明顯。

注：A.當歸對照光譜；B.硫熏當歸樣本1；C.硫熏當歸樣本2。圖6 硫熏當歸樣本紅外光譜分析

圖7所示為當歸藥材對照紅外光譜與同科其他4種根類藥材的紅外光譜。從1200～800 cm-1區域的吸收峰形狀看，傘形科根類藥材中普遍含有蔗糖，說明這些藥材的原植物具有相似的糖類成分代謝和積累途徑，但是當歸中蔗糖相對含量最高，羌活和前胡中蔗糖相對含量較低。川芎、獨活、羌活、前胡這4種藥材與當歸的主要差異還是在1800～1200 cm-1區域，例如1740 cm-1附近的羰基伸縮振動峰。

注：A.當歸對照光譜；B.川芎；C.獨活；D.羌活；E.前胡。圖7 當歸相似藥材紅外光譜分析

3 結論

使用多波段紅外光譜指紋圖譜相似度指標，可以對當歸藥材的質量進行客觀量化的評價，為當歸的全程質量控制提供一種高通量、低成本的快速檢測方法。紅外光譜用于中藥質量評價的最根本優勢在于直接無損：一方面，紅外光譜是化合物的指紋圖譜，不需要進行衍生化等分子標記處理，根據待測樣品的光譜特征即可直接對其成分進行分析；另一方面，各種形態的樣品都可以直接進行紅外光譜測試，不需要進行分離提取等預處理。因此，使用紅外光譜技術可以顯著地節省檢測過程的人力、物力、時間、化學品消耗，而且能夠反映不同類型化學成分的整體信息。但是，中藥樣品不經分離提取而直接進行紅外光譜測試時，樣品中各種成分的吸收信號疊加在一起，相似成分信號重疊難以區分，弱吸收信號被強吸收信號所掩蓋，難以找出微量成分的特征信號。因此，在使用紅外光譜對中藥樣品質量進行初步篩查的基礎上，還應該使用色譜、質譜等方法對特定成分進行更加精確的定性定量檢測，才能夠對中藥樣品進行比較完善可靠的質量評價。