豫西旱作褐土剖面土壤的氧化鐵還原與亞鐵氧化特征*

王旭剛 孫麗蓉 張穎蕾 徐曉峰 郭大勇 石兆勇

（河南科技大學農學院，河南洛陽 471023）

鐵是土壤中豐度最高的可變價過渡金屬元素。Fe（III）氧化物的溶解度遠小于Fe（II）氧化物，故其還原過程伴隨著吸附于表面或者包裹其中的氧化物結合態重金屬的溶解和遷移，進而增加了重金屬As、Co、Mo和Ni的生物有效性和進入食物鏈的風險［1-2］。此外，鐵還原微生物（Iron reducing bacteria, IRB）可以在還原鐵氧化物的同時直接或者間接促進有機污染物的降解［3-4］。

自然界的厭氧環境，如水體［5］、沉積物［6］、土壤［7］均可發現IRB介導的鐵還原過程，甚至旱地農田的耕層土壤中亦存在鐵的還原過程［8］。旱地土壤鐵的厭氧還原過程中99.26%的硝酸鹽被還原［8］，促使氮素可能以N2O形式損失［9］。此外，鐵的還原不利于形成水穩性結構體，引起土壤鐵解［10］，但可增加磷的生物有效性［11］。豫西黃土區土層深厚，耕層以下土壤中鐵氧化物總量隨剖面呈現一定的增加趨勢，但與表層土壤差異不大［12］。雖然土壤剖面中鐵氧化物的形態及相對含量存在差異［13］，黏土礦物結構中鐵亦可被IRB還原［14-15］，且耕層以下土壤易于保持厭氧環境，但耕層以下土壤中鐵還原、氧化過程特征如何鮮見報道。

近中性條件下，還原產生Fe（II）在厭氧光照條件下可被光合型Fe（II）氧化（Phototrophic ferrous oxidation，PFO）微生物［16］、硝酸鹽依賴性Fe（II）氧化（Nitrate dependent ferrous oxidation，NDFO）微生物氧化［17］，或者被嗜中性微好氧亞鐵氧化菌氧化［18］，其氧化過程中伴隨著生物成礦和與重金屬離子的共沉淀［19］，從而降低重金屬的生物有效性。研究發現水稻土、旱作褐土耕層和表層土壤均存在光合型亞鐵氧化過程，Fe（II）氧化量與土壤無定形鐵、水溶性硫酸鹽含量、陽離子交換量顯著負相關，與土壤總氮、總磷顯著正相關［20-21］。研究發現微生物可以通過氣、水遷移等途徑實現不同區域的水平遷移［22］，且土壤耕層以下土壤與表層土壤存在氣體交換和水分的淋溶入滲，Fe（II）氧化微生物可能隨氣、水或者植物根系而向下遷移。但耕層以下土壤長期不見光。此外，硝酸鹽在旱地農田土壤剖面中出現富集現象，但含量低于研究硝酸鹽依賴型Fe（II）氧化過程采用的硝酸鹽濃度［23-25］，Fe（II）氧化過程是否存在、其特征如何尚不明晰。

鑒于此，本文采用恒溫厭氧泥漿培養的方法研究旱地淋溶褐土的剖面土壤樣品在光照和避光條件下鐵的氧化還原過程，以期探索旱地土壤耕層以下土壤中是否存在鐵還原過程和光合型Fe（II）氧化過程，為拓展對鐵氧化還原微生物生境的認識、深入理解鐵氧化還原過程提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤剖面樣品采自河南省洛陽市洛寧縣王村鄉聶墳村旱作農田（111°39′19.30″E，34°27′14.76″N），土壤類型為褐土。采樣點位于豫西丘陵山區，暖溫帶大陸性季風氣候，海拔561 m，年均降水量570 mm，主要作物為冬小麥/夏玉米。樣品用帶刻度的不銹鋼管型土鉆采集，每20 cm深度取土鉆中心土樣，避光自然風干，粉碎過20目篩備用。供試土壤基本性質見表1。

表1 供試土壤基本性質Table 1 Basic soil properties of the sample profiles

1.2 恒溫厭氧培養試驗

稱取每個剖面深度的土壤樣品3.000 g若干份于容積為10 mL的血清瓶中，加入3 mL去離子水后蓋上橡膠塞，充氮5 min以排出頂空中氧氣，在氮氣保護下加鋁蓋密封，1/2置于光照培養箱（寧波萊福，FPG3）中30±1℃［25］培養作為光照處理（2 000 lux），1/2置于恒溫培養箱（上海博訊，GSP-9270MBE）中30±1℃避光培養（避光處理）。在40 d的持續恒溫培養過程中，定期采樣分析Fe（II）含量。每次采樣時各處理取出3瓶，打開密封鋁蓋和橡膠塞，充分搖勻后用移液器吸取0.4 mL泥漿，溶于預先加入4.6 mL0.5 mol·L-1鹽酸并稱重的塑料離心管中，在30±1 ℃恒溫培養箱中浸提24 h。浸提液過0.22 μm濾膜后測定濾液中Fe（II）濃度。

培養結束后各處理取3瓶，用27 mL去離子水將瓶內泥漿全部洗入100 mL三角瓶，搖勻過濾后分析其水溶性硝酸鹽、硫酸鹽、無機碳和有機碳的含量。

土壤pH、有機碳、堿解氮、有效磷、緩效鉀、速效鉀、陽離子交換量、物理性黏粒采用常規分析方法測試［26］。

0.5 mol·L-1HCl提取Fe（II）、水溶性硫酸鹽、硝酸鹽和水溶性碳含量利用文獻［8］中方法測試。

1.3 數據處理

參照文獻［8］中提到的Logistic方程式擬合避光培養過程中0.5 mol·L-1可提取Fe（II）含量隨時間的變化，求出體系中Fe（II）的最大累積量（還原潛勢）、速率常數、最大速率（Vmax）及其出現的時間。

光照條件下Fe（II）最大累積量為培養過程中Fe（II）的最大值；氧化開始時間為培養過程Fe（II）開始降低的時間；Fe（II）氧化量為Fe（II）的最大值與培養結束時體系Fe（II）含量的差值；Fe（II）氧化速率為平均氧化速率，數值上等于Fe（II）氧化量除以培養過程中氧化持續時間。

數據采用OriginPro 8.5和SPSS 13.0分析處理。

2 結 果

2.1 避光時剖面土壤鐵的還原特征

豫西旱地土壤剖面0～100 cm范圍內均存在鐵還原過程。避光培養過程中不同土層0.5 mol·L-1HCl可提取Fe（II）隨培養時間均呈現“S”型增長趨勢（圖1a），剖面深度并不影響Fe（II）累積趨勢，但剖面不同深度土壤中Fe（II）的累積量之間存在明顯差異（圖1a）。由圖2可知，旱地土壤剖面鐵氧化物的還原潛勢在0～60 cm的深度隨剖面深度的增加顯著降低，60～80 cm和80～100 cm之間無顯著差異。耕層（0～20 cm）和20～40 cm土層中鐵氧化物的還原速率常數、最大速率及其出現時間均無顯著差異，剖面深度超過40 cm后呈現鐵氧化物的還原速率常數、最大速率均呈現顯著降低趨勢，最大速率出現時間則顯著后延。

2.2 光照時剖面土壤鐵的還原及Fe（II）的氧化

光照條件下，0～80 cm土層中Fe（II）隨培養時間的累積趨勢與避光明顯不同（圖1），培養前期表現為Fe（III）還原，后期Fe（II）累積量明顯降低，表現為Fe（II）氧化，說明旱地土壤0～80 cm土層中均存在光合型Fe（II）氧化微生物。

光照條件下20～40 cm 土層中Fe（II）的累積量、氧化量和氧化速率均為最大。除了20～40 cm土層外，Fe（II）累積量、氧化量和氧化速率均隨剖面深度呈現降低趨勢（圖3）。

圖1 剖面土壤避光（a）與光照（b）厭氧培養過程中0.5 mol·L-1HCl可浸提Fe（II）含量變化Fig. 1 Content of 0.5 mol·L-1 HCl extractable Fe（II）in the profile soils under anaerobic incubation in darkness（a）and in light（b）

圖2 避光培養時土壤鐵還原過程的關鍵參數隨剖面深度的變化Fig. 2 Variation of key parameters of the reducing processes of iron in the soil incubated in darkness with soil depth in profile

雖80～100 cm土層在培養過程中未出現Fe（II）累積量降低所表現出的氧化現象，但該土層在30 d培養結束時Fe（II）的累積量為383.3 μg·g-1，較之避光時降低了28.74%。前期Fe（II）最大累積量以20～40 cm土層最大，與剖面深度的關系與避光基本一致。對于耕層（0～20 cm）和20～40 cm土層而言，雖然Fe（II）分別在培養12 d和15 d時開始明顯降低，但均自第7 天開始不再明顯上升，顯著區別于避光處理（圖1 a）。

2.3 培養結束后的水溶性碳

在避光或光照條件，培養結束后剖面土壤中水溶性有機碳均呈現降低趨勢，減少量隨剖面深度增加而降低（圖4）。避光處理水溶性有機碳平均降低19.38 mg·kg-1，平均降幅14.98%；不同土層減少量隨剖面深度減小，降幅在0～60 cm土層之間未見顯著變化；光照處理水溶性有機碳平均降低34.62 mg·kg-1，平均降幅32.09%。

避光培養顯著增加了剖面中水溶性無機碳的含量，平均增量55. 50 mg·kg-1，增量在0～60 cm深度隨剖面深度增加而顯著減少，40～100 cm深度土層之間無顯著差異（圖5）。光照培養結束后剖面土壤水溶性無機碳含量平均為21.65 mg·kg-1，不同深度土層之間無顯著差異。光照培養降低了0～80 cm土層中水溶性無機碳的含量，減少量介于16.45～39.80 mg·kg-1之間（圖5）。

進一步分析培養過程水溶性碳變化量與鐵氧化還原關鍵參數的關系發現（表2），避光時鐵還原潛勢與水溶性無機碳增量之間存在正相關關系，鐵還原速率常數、最大速率與水溶性有機碳減少量呈顯著正相關關系，顯示鐵的避光還原過程促進了有機碳的礦化。光照時，Fe（II）氧化量與水溶性無機碳減少量顯著正相關，氧化速率水溶性有機碳變化量正相關（表2），其原因可能與水溶性無機碳被光合產氧微生物用以產氧，促使Fe（II）的再氧化有關。

圖3 光照培養時鐵還原氧化過程的關鍵參數隨剖面深度的變化Fig. 3 Variation of key parameters of iron redox processes in the soil anaerobically incubated in light with soil depth in profile

圖4 厭氧培養結束后剖面土層中水溶性有機碳含量（a）及減少量（b）Fig. 4 Water soluble organic carbon in the soil profile after anaerobic incubation,（a）content and（b）amount reduced

2.4 培養結束后的水溶性硝酸鹽和硫酸鹽

培養結束后，體系中水溶性硝酸鹽含量如表3所示，可以看出無論避光還是光照條件，培養結束后水溶性硝酸鹽含量均呈現降低趨勢，降幅介于83.41%～98.60%，且隨剖面深度增加而減少。光照處理平均降幅93.12%，與避光處理的降幅之間無顯著差異。

圖5 厭氧培養結束后剖面土層中水溶性無機碳含量（a）及變化量（b）Fig. 5 Water soluble inorganic carbon in the soil profile after anaerobic incubation,（a）content and（b）variation

表2 鐵氧化還原關鍵參數與培養過程水溶性碳、硝酸鹽、硫酸鹽變化量的相關系數Table 2 Correlation coefficient between key parameters of iron redox and variations of water soluble carbon, nitrate and sulphate in the process of anaerobic incubation

避光培養結束后水溶性硫酸鹽含量降低，降幅介于22.19%～92.36%，降幅隨剖面深度增加而減少（表4）。光照培養結束后0～40 cm土層水溶性硫酸鹽含量略有增加，增幅介于7.30%～8.63%；40～100 cm土層水溶性硫酸鹽含量降低，降幅15.21%～26.44%。

相關分析顯示，水溶性硝酸鹽減少量與避光時鐵還原潛勢、最大還原速率之間存在極顯著正相關關系，與光照時鐵的還原量、再氧化量及再氧化速率呈顯著正相關關系（表2）。避光時水溶性硫酸鹽減少量與鐵還原潛勢、最大還原速率呈極顯著正相關關系；光照時與最大Fe（II）產生量、再氧化量、再氧化速率之間存在顯著負相關關系。

2.5 鐵還原氧化關鍵參數與培養前土壤性質的關系

本試驗在特定土壤的垂直方向上探索了土壤性質與鐵氧化還原的關系（表5）。避光時鐵還原潛勢與培養前有機碳、水溶性有機碳含量顯著正相關，這與以前在不同地區耕層土壤水平方向得到的結果一致［8］；同時也與水溶性硝酸鹽含量、有效磷含量、速效鉀含量顯著正相關，與物理性黏粒含量顯著負相關。由此可見耕層以下土壤有效態N、P、K含量較低可能是制約鐵還原的原因之一。鐵還原的最大速率除與上述指標正相關外，還與水溶性硝酸鹽顯著正相關。

表3 培養結束剖面土層中水溶性硝酸鹽含量Table 3 Water soluble nitrate in the soil profile after the incubation

表4 培養結束剖面土層中水溶性硫酸鹽含量Table 4 Water soluble sulfate in the soil profile after the incubation

光照時影響最大Fe（II）產生量的因素與避光時的因素基本相同。Fe（II）的氧化量除與培養前水溶性有機碳、緩效鉀、速效鉀、水溶性硝酸鹽含量正相關外，也與水溶性無機碳含量顯著正相關，說明光照時Fe（II）氧化的過程需要消耗土壤的水溶性無機碳。Fe（II）氧化速率則與有機碳、水溶性有機碳、緩效鉀、速效鉀、水溶性硝酸鹽正相關。

3 討 論

褐土是我國小麥與玉米產區的重要土壤類型之一，分布總面積達2.52×107hm2，具有低有機碳、高碳酸鹽等特征［12］。土壤有機質和全氮含量是褐土區農業生產和可持續發展的重要影響因素［27］。土壤鐵氧化物的厭氧還原與有機碳的礦化、氮的損失密切相關，且受土壤pH［28］、有機碳［29］、含水量和光照［30］等因素影響。

本試驗顯示避光時豫西旱地褐土0～100 cm的剖面土壤中的鐵氧化物均可被還原，鐵還原潛勢介于0.92～3.95 mg·g-1之間，表明鐵還原微生物可在旱地土壤剖面0～100 cm深度存在，拓展了對鐵還原微生物生境的認識。不同區域褐土中鐵還原潛勢與有機碳含量之間存在顯著正相關關系［8］，本試驗結果顯示鐵還原潛勢與有機碳含量之間的正相關關系在土壤剖面中依然存在（表2）。耕層以下土壤尤其是40 cm以下，長期少人為耕作擾動，處于厭氧狀態，而且鐵氧化物含量有增加趨勢［12］，但厭氧培養后鐵還原量較之表層顯著降低，可能原因之一就是40 cm以下土壤有機碳含量平均含量3.20 mg·g-1，不足0～40 cm土層的1/2。此外，下層土壤底物供給不適宜微生物繁育，研究也顯示土壤微生物量碳隨剖面深度顯著降低［31］；下層土壤鐵氧化物活化度較低［32］也可能是下層土壤鐵還原潛勢顯著降低的原因。

表5 鐵氧化還原關鍵參數與培養前土壤性質的相關系數Table 5 Correlation coefficient between key parameters of iron redox and soil properties before the incubation

土壤硝酸鹽也與鐵還原關系密切。一方面硝酸鹽（7.5 mmol·L-1）可作為競爭電子受體而抑制鐵的還原［33］，其抑制作用可因鐵氧化物結晶程度和比表面不同而異［33］，亦可因外加碳源而緩解［34］。另一方面硝酸鹽可作為微生物可利用之氮源而被同化吸收［35-36］。本試驗條件下（硝酸鹽含量2.11～13.56 mg·kg-1）土壤中鐵還原潛勢和最大還原速率與培養前土壤硝酸鹽含量、培養前后硝酸鹽減少量之間的顯著正相關關系（表2和表5）顯示了硝酸鹽對鐵還原的促進作用。此外，研究也發現硝酸鹽還原菌Pseudogulbenkiania sp. strain 2002在還原硝酸鹽的同時伴隨著細胞的生長，細胞蛋白質含量由20 μg·mL-1增加至30 μg·mL-1［37］，表明了硝酸鹽還原菌對氮的同化需求。低濃度（＜2.0 mmol·L-1）硝酸鹽可以通過促進細胞活性而促進鐵的還原［38］。故而，硝酸鹽可能是在滿足微生物自身對氮的同化需要的條件下才可表現為鐵氧化物異化還原的競爭電子受體。外加硝酸鹽對鐵氧化還原過程的濃度效應因土壤而異，0.59 mmol·L-1硝酸鹽可促進Pseudogulbenkiania sp. strain 2002實現氧化Fe（II）的功能［37］；外加低濃度硝酸鹽（0～1.0 mmol·L-1）可促進廣東恩平水稻土中鐵的還原，且1.0 mmol·L-1硝酸鹽的促進作用高于0.5 mmol·L-1［39］；重復添加1.0 mmol·L-1硝酸鹽對意大利維切利水稻土中Fe（II）累積并無影響，對該土壤經過有機質耗竭（30℃厭氧培養3個月）后則表現出輕微不顯著的抑制［34］。硝酸鹽是否會對本試驗所用樣品中鐵還原過程產生抑制、產生抑制所需硝酸鹽的量仍需要進一步研究。

厭氧條件下還原產生Fe（II）可被PFO［16］、NDFO微生物氧化［17］。NDFO對Fe（II）的氧化受NDFO微生物種類數量、碳源、硝酸鹽含量等因素影響，但不需要光。硝酸鹽還原菌Thiobacillus denitrificans和Pseudomonas stutzeri可在將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的同時氧化Fe（II）［37,40］。Klebsiella pneumoniae L17即可還原硝酸鹽亦可還原Fe（III）［41］。電子供體受限時硝酸鹽還原菌在與鐵還原菌競爭電子供體時占優勢［34］；但也有研究顯示江西鷹潭水稻土（pH=5.90）添加生物炭pH升至6.60～7.92后反硝化菌豐度降低而鐵還原菌豐度增加［42］。本試驗（pH介于7.97～8.17）結果也顯示培養前水溶性硝酸鹽與鐵還原潛勢、最大還原速率之間均存在極顯著正相關關系（表3），但避光培養過程中未見Fe（II）氧化現象（圖1 a）。原因可能是：（1）本試驗樣品中硝酸鹽濃度不足以激活硝酸鹽依賴型Fe（II）氧化微生物，研究硝酸鹽依賴型Fe（II）氧化過程采用的硝酸鹽濃度多為4.5～10.0 mmol·L-1［25,43］；（2）無論是DIRB、PFO或者NDFO的繁育均需要氮，而本試驗條件下鐵還原微生物與硝酸鹽依賴型Fe（II）氧化微生物競爭氮源的過程中占優勢［42］。

自然條件下耕層以下土壤長期不見光，可能并不存在光合型F e（I I）氧化現象。本試驗對耕層及以下土層土壤進行光照刺激的恒溫培養試驗發現，采自剖面0～8 0 c m的土壤樣品中均可發生F e（I I）的厭氧氧化，氧化量介于0.26～1.21 mg·g-1。此外，光合型Fe（II）氧化微生物在同化無機碳的同時氧化Fe（II）［44］。本試驗結果也顯示光照時水溶性無機碳顯著降低，且Fe（II）氧化量與水溶性無機碳減少量顯著正相關（表2），與孫麗蓉等［29］研究結果一致。由此，本試驗數據可在側面顯示光合型Fe（II）氧化微生物可能隨水分的淋溶入滲而在0～80 cm土層存在。80～100 cm土層未見Fe（II）氧化現象，但其光照時鐵氧化物還原量顯著小于避光時還原量。此外，雖80～100 cm土層經過光照培養后與避光處理一樣增加了水溶性無機碳含量，但增幅顯著小于避光處理（圖5b）。這一差異的原因究竟是光照抑制了鐵還原微生物對鐵的異化還原過程，還是雖然存在光合型Fe（II）氧化過程，受限于80～100 cm土壤有機碳、水溶性無機碳含量低或者其他因素而使Fe（II）氧化速率小于Fe（III）還原速率，仍需進一步直接分析光合型Fe（II）氧化微生物可在土壤剖面淋溶的深度并配合外加碳源、氮源等試驗予以證實。

4 結 論

黃河中下游旱地土壤剖面0～100 cm土層存在鐵氧化物的厭氧還原過程，鐵還原潛勢隨剖面深度增加顯著降低，0～40 cm土層的還原速率常數、最大還原速率和最大速率出現時間均顯著高于40 cm以下土壤。旱地土壤剖面0～80 cm土層存在光合型Fe（II）氧化現象，且0～40 cm土層Fe（II）氧化量和氧化速率顯著高于40～80 cm土層。剖面土壤鐵氧化還原過程不僅受到有機碳含量的影響，也受到硝酸鹽、鉀等養分元素的影響，硝酸鹽和鉀不僅促進光照時Fe（II）的氧化，亦促進避光時鐵的還原。