小膠質細胞老化導致多巴胺能神經元炎性介質釋放的研究

曹丹 任艷 羅曉光 魏玲

隨著人口老齡化趨勢到來, 帕金森氏病(PD)這一中老年常見的神經系統變性病越受到研究者重視, 其發病率隨年齡增長而顯著增加, 85歲以上的老人接近50%有輕度PD樣癥狀。其發病機制可能與年齡老化、環境因素、氧化應激、線粒體功能障礙、膠質細胞增生和炎癥反應等有關, 但線粒體功能障礙早已成為早期病理現象受到研究者們的關注。迄今為止有關PD的治療均為對癥治療, 無法進行根本有效的病因治療。因此, 尋找一種能減少多巴胺(DA)能神經元丟失及阻斷或延緩病程發展的治療方法是目前亟待解決的難題。

1 材料與方法

1.1 材料 MI為原代大鼠的神經MI(購于PriCells生物醫藥科技有限公司)。

1.2 MI培養 MI取對數生長期細胞用于實驗, 以終濃度100 ng/ml PMA刺激MI 72 h后為共育時所需老化MI。

1.3 PC12傳代培養 復蘇后的PC12細胞并傳代培養(購于中國科學院細胞研究所), 取對數生長期細胞用于實驗。以低劑量250 nM魚藤酮刺激PC12細胞8 h后, 收集損傷PC12細胞于24孔板上。

1.4 實驗分組 將刺激后的MI及轉移篩網移入有受損的PC12細胞的培養板內建立兩種細胞的共育系統, 實驗分為3組：A組(空白對照組)： PC12細胞, 未給予任何處理藥物；B組：PC12與老化MI共育；C組：魚藤酮損傷PC12與老化MI共育。共育24 h結束后移走轉移篩板及其上面的細胞,對收集PC12細胞進行膜電位及ROS檢測。

1.5 MI老化相關β-半乳糖苷酶(β-gal)染色 每孔加入300 μl β-gal染色固定液, 室溫固定 15 min；PBS洗滌3次；每孔加入300 μl染色工作液(試劑盒購于上海碧云天)；37℃無CO2溫箱孵育過夜；普通光學顯微鏡下觀察。

1.6 PC12細胞線粒體膜電位檢查 采用JC-1標記法(試劑盒購于碧云天, 上海), 加入500 μl JC-1染色工作液, 37℃細胞培養箱中孵育20 min, 吸除上清, 用JC-1染色緩沖液洗滌2次, 加入400 μl細胞培養, 流式細胞儀檢測分析。

1.7 PC12細胞內ROS水平檢測 細胞收集后懸浮于稀釋好的2', 7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(10 μmol/L)中,37℃細胞培養箱內孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸, 無血清細胞培養液洗滌3次, 流式細胞儀檢測。

1.8 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 多組資料用One-Way ANOVA方法進行比較。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 老化MI形態鑒定 β-gal是一種鑒別細胞衰老的生物學標志。細胞內產生的藍色沉淀物即表明細胞進入衰老狀態。實驗結果顯示, PMA刺激MI藍染陽性細胞數明顯增加。

2.2 老化MI及魚藤酮干預對PC12細胞線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位是細胞損傷極為敏感的指標之一, 膜電位的下降可以反映細胞凋亡早期的變化。本研究通過流式細胞儀檢測PC12細胞線粒體膜電位, 用FL1/FL2評價線粒體損傷情況, 比值越高損傷越嚴重。實驗結果顯示, C組FL1/FL2最高, B組、C組FL1/FL2均高于A組, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。說明C組細胞線粒體膜電位最低, B組、C組細胞線粒體膜電位均低于A組。

表1 三組FL1/FL2比較( ±s, n=3)

表1 三組FL1/FL2比較( ±s, n=3)

注：與A組比較, aP＜0.05

組別 FL1/FL2 A組 1.03±0.16 B組 1.40±0.10a C組 1.57±0.14a

2.3 老化MI及魚藤酮干預對PC12細胞ROS水平的影響 本研究通過流式細胞儀檢測細胞內二氯二氫熒光素(DCF)熒光強度, 用平均熒光強度值評價細胞內ROS水平。實驗結果顯示, C組細胞DCF熒光強度最高, B組、C組與A組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表2。說明C組細胞ROS水平最高, B組、C組細胞ROS水平高于A組。

表2 三組DCF熒光強度比較(±s, n=3)

表2 三組DCF熒光強度比較(±s, n=3)

注：與A組比較, aP＜0.05

組別 DCF熒光強度A組 171.07±17.26 B組 846.97±25.08a C組 982.72±25.1a

3 討論

MI的激活和炎癥反應在PD 神經變性病中的作用越來越受到學者的重視［1］。大量病理學證據均支持MI過度活化是黑質區DA神經元損傷的重要原因, 推測老化MI可分泌各種炎性介質, 持續對周圍微環境施加影響。當腦內老化MI大量存在時, 微環境發生改變, 遭遇病理刺激后發生過度炎癥反應, 引發氧化應激產物的大量釋放, 促進了DA神經元的死亡。研究發現, 線粒體損傷及功能改變在細胞凋亡過程中起到重要作用, 線粒體功能下降包括膜電位減低, 氧化磷酸化-電子傳遞偶聯異常等, 最終導致神經細胞凋亡［2］。調控細胞凋亡的一些因子, 如細胞色素C(Cyt-C)、Bcl-2家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶前體等都定位于線粒體內, 從而破壞線粒體膜的通透性和完整性。

魚藤酮是一種特異性線粒體復雜體Ⅰ抑制劑［3］。通過抑制線粒體復合體Ⅰ, 促進ROS的形成, 產生氧化應激導致線粒體功能障礙, 從而導致DA神經元的死亡。本實驗中老化MI同損傷的神經細胞進行共育, 實驗結果發現, 老化MI顯著減低了正常PC12和受損PC12的線粒體膜電位并且提高了ROS分泌水平。提示在本實驗環境下, 老化MI不利于損傷神經細胞的恢復, 具有神經毒性作用。

近年來, 越來越多研究證實自由基在PD發生發展中起著重要的作用。當線粒體呼吸鏈受到抑制, 線粒體膜通透性轉換可誘導ROS生成。當防御機制受到攻擊時, 大量氧自由基積聚造成對膜不飽和脂肪酸的攻擊, 引發脂質過氧化作用,使以丙二醛為主的脂質過氧化產物增多, 進一步引起細胞代謝和功能障礙, 造成細胞損傷［4］。ROS是魚藤酮誘導神經細胞死亡的最重要因素之一。魚藤酮誘導PC12細胞ROS水平的增加, 在老化MI刺激下, ROS生成進一步加重, 從而進一步損害線粒體電子傳遞。本研究發現, 在老化微環境中魚藤酮組PC12可顯著增加ROS水平。

綜上所述, 線粒體損傷與PD的關系非常緊密, 一方面可以為疾病提供早期診斷提供依據, 從亞細胞和分子水平研究其與PD的關系, 另一方面對新藥研發的設計都有重要的指導意義。