四川地區豬源致病性大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性檢測

張敏 ，李旭廷 ，王斌 ，雷昌偉 ，李思聰 ，王紅寧 *

（1.四川大學生命科學學院，四川 成都 610065；2.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066）

大腸桿菌是人和動物腸道共生菌群的組成部分，部分致病性大腸桿菌能引起人和動物的腹瀉、敗血癥等多種癥狀[1]。大腸桿菌在藥物選擇壓力下，易產生耐藥性，并可通過菌毛將耐藥質粒傳遞給其他大腸桿菌，因而給大腸桿菌病的藥物防控帶來了較大的挑戰[2]。本研究對四川地區的豬源樣品進行了大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析，以期為合理使用抗生素提供依據。

1 材料

1.1 樣本采集 從四川地區40個豬場采集病死豬的腸道內容物、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結、血液作為病料樣本，置無菌樣品袋中，冰盒保存，12h內送回實驗室進行細菌分離。

1.2 試劑和標準菌株 麥康凱瓊脂、營養肉湯、MH瓊脂、普通營養瓊脂、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑公司；標準菌株為大腸桿菌標準株（ATCC 25922），購自中國獸藥監察所。

1.3 實驗動物 昆明系SPF小鼠，購自四川達碩生物技術有限公司。

2 分離鑒定方法

2.1 病料接種 無菌切取病變組織和正常組織交界處的小組織塊置肉湯培養基中，37℃下增菌培養24h。然后蘸取增菌液劃線于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板上，37℃純化培養24h。

2.2 菌落形態特征觀察 當伊紅美藍瓊脂上出現黑棕色或棕綠色且帶有金屬反光的菌落，或出現中心黑點、邊緣灰白的表面光滑的菌落；麥康凱瓊脂上出現典型紅色或粉紅色的光滑菌落；1000×油鏡下觀察為革蘭氏陰性桿菌。符合以上特征的基本判定為大腸桿菌，然后作進一步的分子鑒定。

2.3 16S rDNA PCR測序鑒定[3]從伊紅美藍瓊脂或麥康凱瓊脂上挑取純化后的典型單個菌落進行PCR實驗，擴增細菌16S rDNA基因。引物為通用引物27F（5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,）和 1492R（5,-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3,），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應條件：95℃5min，95℃ 1min、50℃ 1min、72℃ 2min（30次循環），72℃ 8min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，預擴增片段1 450 bp，并由上海生工生物工程技術服務有限公司純化并測序，序列結果用 NCBI BLAST搜索比對，鑒定標準按照同源性≥97%判定。

2.4 致病性試驗 將鑒定了的豬源大腸桿菌接種到MH 瓊脂平板，經 37℃ 24h純培養后，用滅菌生理鹽水洗下菌落，調整菌液渾濁度與0.5麥氏比濁管（1×108CFU/mL)相當，再分別腹腔注射小白鼠（0.2mL/只），每株菌同時接種3只小鼠，并設標準株 ATCC 25922為對照，觀察分離菌株對小鼠的致病性。

2.5 藥敏試驗 菌株于MH肉湯中37℃恒溫培養8～12h后，使用光度比濁儀將培養物用生理鹽水稀釋為0.5倍麥氏濃度。再用滅菌棉簽劃線接種于整個表面干燥的MH瓊脂平板上，并確保每次接種均勻分布。然后用藥敏紙片分散器將紙片均勻貼在瓊脂平板表面，37℃恒溫培養12～16h后，測量抑菌圈大小。

3 結果

3.1 細菌分離 從40個豬場采集的125個病料樣品中，分離到了37株大腸桿菌，分離率達29.6%。各個臟器的分離率分別為：腸道內容物45.95%（17/37），肺臟 13.52%（5/37），淋 巴結 8.1%（3/37），肝臟10.81%（4/37），心臟 5.4%（2/37），脾臟 8.1%（3/37），腎臟 2.72%（1/37），血液 5.4%（2/37）。

3.2 致病性試驗 用37株大腸桿菌攻毒小鼠后，有9株導致1只小鼠死亡，16株導致2只小鼠死亡，12株導致3只小鼠死亡，平均致死率為69.36%。引起至少2只小鼠死亡的28株菌中，有24株引起小鼠死亡的時間不超過18h。從死亡小鼠的肺臟、肝臟等器官中也分離到了同種菌。對照組無死亡。

3.3 耐藥性檢測 37株大腸桿菌的藥敏試驗結果見表1。結果表明，分離株對四環素、阿莫西林、復方新諾明、氨芐西林、慶大霉素、強力霉素有嚴重耐藥性，耐藥率高于80%，四環素的耐藥率甚至達到了100%；對阿米卡星具有較高的敏感性，耐藥率為13.5%。37株大腸桿菌全部表現為多重耐藥，至少耐6種及以上受試藥物，存在20種不同的耐藥譜。表明四川地區豬源大腸桿菌致病菌株的耐藥性強、耐藥譜廣。

表1 大腸桿菌分離株的耐藥性檢測

4 討論

4.1 藥敏試驗結果顯示37株耐藥大腸桿菌對阿米卡星的敏感性較高，與2017年孔令漢等[4]、2015年王斌等[5]報道的結果一致，可能與該藥尚未允許在獸醫臨床使用有關。值得關注的是，分離菌株中仍有13.5%對阿米卡星耐藥，其耐藥機制值得進一步探究。

4.2 β-內酰胺類抗生素不僅是獸醫臨床重要的抗生素，也是人醫臨床常用的抗生素品種，監測動物源細菌對β-內酰胺類抗生素的耐藥性不僅對畜牧業健康發展有著重要意義，而且對人醫臨床也有著重要參考價值。本次試驗分離的37株豬源大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林的耐藥性高達90%以上，與曾博等[6]、王斌等[5]研究的結果相似。特別值得關注的是，近年來復方β-內酰胺酶抑制劑類抗生素和頭孢類抗生素的耐藥性在顯著增加，可能與這兩類藥物在臨床上的大量使用有關，建議養殖戶在使用抗生素治療豬病時，先篩選出有效藥物再治療，以避免抗生素濫用。