益骨湯對骨質疏松大鼠成骨細胞相關基因表達的實驗研究*

李桂錦 姚新苗

浙江中醫藥大學附屬第三醫院 浙江 杭州 310005

WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1表達水平的變化，探討益骨湯治療骨質疏松的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：采用SPF級12周齡雌性SD大鼠100只，體重200±10g，浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(滬)20080016，用于造模。

1.2 主要試劑與儀器：益骨口服液（方由補骨脂10g，骨碎補、生地、仙靈脾、懷山藥各15g，丹參30g組成），由浙江省中醫院中藥房提供，制成含生藥量1.0g/ml的水提液，用于去勢大鼠灌胃治療）；倍美力水溶液：美國惠氏艾爾斯特制藥公司艾爾斯特藥廠制造,產品批號0502090,國藥準字(2001)J51(2)號。水溶液濃度為9.4μg/ml。氯氨酮：上海第一生化藥業有限公司生產,批號滬衛藥準字(1995)第001064號；DKK1反義寡核苷酸序列如下：5′-TCTGGTCCAAGATCTGAT-3′由上海生物工程合成；WNT10b、β-catenin、BMP2、BMP4、DKK1酶聯免疫檢測試劑盒(R&D Systems美國)；WNT10b、βcatenin、BMP-2、BMP-4、DKK1的PCR引物（艾菲生物技術有限公司）；PCR儀（BIO-RAD 美國）；紫外分析圖像處理儀（上海天能科技有限公司）；電泳儀（BIO-RAD 美國）；半自動生化分析儀(上海三科儀器有限公司)；紫外分光光度計（Eppendorf 德國）；海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）；液氮容器（樂山市東亞機電工貿有限公司）；雙能X線骨密度儀（型號：DPX-L美國LUNAR公司）。

1.3 實驗分組：隨機分為A組(假手術組)、B組(益骨湯治療組)、C組(倍美力陽性對照組)、D組(正常對照組)、E組（DKK-1反義寡核苷酸對照組）5組,分16籠以常規飼料喂養,自由飲水。飼養室保持良好通風,室溫控制在21±1℃,濕度63%,噪音＜55分貝,自由攝食、飲水,光照與黑暗時間為每12h交替。

1.4 動物造模：大鼠采用氯胺酮按0.1g/kg進行腹腔麻醉,然后打開B、C、D、E組大鼠腹腔,去除雙側卵巢,逐層縫合；A組大鼠僅予以單純剖腹后立即關閉。術后予以青霉素肌注預防感染，按4萬U/只/d，持續3d。

1.5 飼養與給藥：造模術后將SD大鼠分16籠予以常規飼料喂養12周,第13周起開始每天給藥,A、D組以蒸餾水10ml/kg灌胃；B組以10ml/kg的益骨湯水提液灌胃；C組以濃度為9.4μg/ml倍美力水溶液10ml/kg灌胃,整個灌胃過程持續12周；E組予以DKK1反義寡核苷酸腹膜內注射20μg/kg/d，持續12周。

1.6 股骨骨密度檢測：取大鼠股骨，剔除周圍的肌肉，密封保存標本于－20℃冰箱內，采用雙能X線骨密度測量儀，通過計算機系統軟件，測量每只大鼠股骨BMD，取平均值，BMD值用g/cm2表示。

1.7 Wnt/β-catenin信號通路相關目的基因的提取、檢測：采用Trizol法提取組織總RNA，紫外分光光度儀測定各組提取的總RNA濃度。

表1 各基因引物序列

1.8 WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1 mRNA的表達：根據NCBI網站GeneBank查詢目的基因WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1 mRNA序列，引物合成使用Primer Premier 5．0軟件，序列見表1。RNA定量后反轉錄合成第一鏈cDNA,用熒光定量PCR系統進行PCR反應，PCR總反應體系（25μl）為：加入TaqcDNA聚合酶1μl，10×PCR反應緩沖液4μl，dNTP 2μl，上下游引物各0.5μl，cDNA產物5μl和滅菌水12μl，按照各目的基因退火溫度選擇三步法完成擴增，循環45次。根據熔解曲線判斷PCR擴增產物的特異性，由所得的循環閾值(Ct)，根據 2-△△Ct法分別計算目的基因 DKK1、βcatenin在各組中的表達量。

1.9 統計學方法：采用SPSS17.0軟件進行分析統計，計量資料以均數±標準差(-x±s)表示，各組數據的兩兩比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊性采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組骨密度比較：與A組比較，D組骨密度明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01），說明造模成功；B組、C組、E組的骨密度均明顯高于D組(正常對照組)，差異有統計學意義（P＜0.01）；B組的骨密度與C組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組去勢大鼠右股骨上端骨密度結果比較（-x±s）

2.2 各組大鼠 WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1蛋白含量比較：與D組比較，B組、C組、E組WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4蛋白光密度增加，DKK1蛋白光密度減少，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；B組DKK1蛋白光密度與C組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；E組WNT10b蛋白光密度低于B組，差異有統計學意義（P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠成骨細胞5組蛋白光密度的變化（-x±s）

2.3 mRNA水平檢測：各組Wnt10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1相對表達水平的熒光定量PCR擴增曲線分析表明，各基因的熒光定量RT-PCR均為特異性擴增。同時，熒光定量RT-PCR產物的溶解曲線分析也表明，各基因的熒光定量RT-PCR均為單一的溶解峰。以正常對照組作為校驗樣本，以β-catenin作為參照基因，用2-△△CT方法計算相對基因表達量，D 組的 WNT10b、βcatenin、BMP-2、BMP-4的表達量低于A組（偽去勢組），而DKK1的表達量明顯高于偽去勢組，說明去除大鼠卵巢，可以使DKK1過度表達；而B組的WNT10b、βcatenin、BMP-2、BMP-4的表達量高于A組，DKK1的表達量低于A組。見圖1。

圖1 各組Wnt10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4、DKK1基因表達分析

3 討論

中醫學無“骨質疏松”病名，但根據其臨床表現，可歸屬于中醫學中“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇，認為病變在骨，其本在腎，其病性多虛多瘀、本虛標實。補腎活血法體現中醫標本兼顧的思想，是治療骨質疏松的主要治法。益骨湯是姚新苗教授根據補腎活血的治療方法，并結合多年臨床經驗提煉的治療骨質疏松癥驗方，由補骨脂、骨碎補、生地、仙靈脾、懷山藥、丹參等6味中藥配伍而成。方中補骨脂、骨碎補為君藥,補腎填精,強壯筋骨；生地、仙靈脾補腎滋陰；脾為后天之源，脾主肌肉，取懷山藥為臣藥；因久病必瘀，而致疼痛，以丹參活血化瘀。

近年來研究認為，絕經后骨質疏松癥的發病機理主要為絕經后雌激素水平降低改變了成骨細胞、破骨細胞的功能、數量、壽命，從而影響骨形成、骨吸收偶聯，進而導致絕經后骨質疏松癥的形成[1]，骨重建使人體的骨代謝保持在動態平衡狀態。骨重建包括破骨細胞介導的骨吸收以及成骨細胞介導的骨形成[2]。如骨吸收超過了骨形成的代償，就會導致骨質疏松。因此治療骨質疏松可以從促進成骨細胞及抑制破骨細胞兩方面著手。成骨細胞能夠促進骨組織的發育、形成和重建，同時加強骨質量及骨強度。研究認為多種信號通路均能影響成骨細胞增殖，而其中經典WNT信號通路、BMP-2通路活化與促成骨細胞增殖是近年來研究的熱點。WNT信號通路中βcatenin、WNT10b蛋白與OP的發生密切相關[3]，WNT10b基因缺失小鼠其成骨細胞數量及活性顯著下降，并導致骨質疏松癥的發生[4]，β-catenin經過WNT/LRP5/βcatenin/TCF/LEF級聯反應過程促使下游成骨靶基因的表達[5]，DKK1是經典WNT信號通路的抑制劑,能特異性的抑制經典WNT/β-catenin信號通路[6]。研究[7]證實BMP信號通路能調控成骨細胞生命周期的各個方面。BMP家族中BMP-2是促進骨形成和誘導成骨細胞分化重要的細胞外信號分子之一，有研究[8]表明BMP-4參與骨修復過程,是其他骨局部生長因子發揮生物學效應的必需因子。

本研究通過骨密度測定結果，我們發現B組、C組、E組成骨細胞數量明顯增加，高于正常對照組。而B組又明顯高于其他對照組，從以上結果可以確定益骨湯、DKK-1反義寡核苷酸能促進成骨細胞分化、增殖，加速骨形成，從而治療骨質疏松癥。蛋白測定及PCR結果顯示B組、E組對WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4表達比D組明顯上調（P＜0.05），且B組4基因的表達明顯高于其他組；而B組DKK1的表達比D組明顯下調（P＜0.05）；此結果說明益骨湯能夠促進WNT10b、βcatenin、BMP-2、BMP-4基因表達上調，可以抑制DKK1在成骨細胞增殖中的過度表達，從而推斷，益骨湯促骨質疏松成骨細胞增殖機制與上調WNT10b、β-catenin、BMP-2、BMP-4在成骨細胞的表達，抑制DKK1過度表達有關。益骨湯可能通過調節經典WNT信號通路和BMP-2信號通路的相互關系，來實現誘導成骨細胞增殖，但其具體的機制有待于進一步研究。

4 參考文獻

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