HPLC法同時測定四味姜黃湯散中7種成分的含量

趙婭　馮慧　周珍　郝露　周邦華　賴先榮

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）01-0029-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.08

摘 要 目的：建立同時測定四味姜黃湯散中沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和姜黃素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Capcell Pak C18-MGⅡ，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測波長為270 nm（0～60 min，沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿）和428 nm（60～70 min，姜黃素），柱溫為30 ℃，進樣量為10 ?L。結果：沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和姜黃素進樣量檢測線性范圍分別為0.249 6～1.497 6、0.284 0～1.704 0、0.075 6～0.453 6、0.015 9～0.095 9、0.023 6～0.141 6、0.098 2～0.589 0、0.060 4～0.362 4 ?g（r≥0.999 8）；檢測限分別為6.24、4.73、7.56、2.36、3.20、6.54、6.04 ng，定量限分別為17.47、16.08、20.86、7.31、10.24、19.62、19.32 ng；精密度、穩定性（12 h）、重復性試驗的RSD<2.0%（n=6）；加樣回收率為95.45%～103.47%，RSD為0.86%～1.98%（n=9）。結論：建立的方法操作簡便，結果準確可靠，適用于四味姜黃湯散中沒食子酸等7種成分含量的同時測定。

關鍵詞 四味姜黃湯散；高效液相色譜法；沒食子酸；木蘭花堿；鞣花酸；鹽酸藥根堿；鹽酸巴馬??；鹽酸小檗堿；姜黃素；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of gallic acid， magnoflorine， ellagic acid， jatrorrhizine hydrochloride， palmatine hydrochloride， berberine hydrochloride and curcumin in Siwei jianghuang decoction powder. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Capcell Pak C18-MG Ⅱ column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelengths were 270 nm （0-60 min， gallic acid， magnoflorine， ellagic acid， jatrorrhizine hydrochloride， palmatine hydrochloride， berberine hydrochloride） and 428 nm （60-70 min， curcumin）. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 10 ?L. RESULTS： The linear ranges of gallic acid， magnoflorine， ellagic acid， jatrorrhizine hydrochloride， palmatine hydrochloride， berberine hydrochloride and curcumin were 0.249 6-1.497 6， 0.284 0-1.704 0， 0.075 6-0.453 6， 0.015 9-0.095 9， 0.023 6-0.141 6， 0.098 2-0.589 0 and 0.060 4-0.362 4 μg （r≥0.999 8）. The limits of detection were 6.24， 4.73， 7.56， 2.36， 3.20， 6.54， 6.04 ng， and the limits of quantitation were 17.47， 16.08， 20.86， 7.31， 10.24， 19.62， 19.32 ng， respectively. RSDs of precision， stability （12 h）， reproducibility tests were lower than 2.0% （n=6）. The recoveries were 95.45%-103.47% （RSD=0.86%-1.98%， n=9）. CONCLUSIONS： Established method is simple， accurate， reliable and suitable for simultaneous determination of 7 components such as gallic acid in Siwei jianghuang decoction powder.

KEYWORDS Siwei jianghuang decoction powder； HPLC； Gallic acid； Magnoflorine； Ellagic acid； Jatrorrhizine hydrochloride； Palmatine hydrochloride； Berberine hydrochloride； Curcumin； Content determination

四味姜黃湯散（藏藥名：勇哇西湯）由君藥姜黃、臣藥小檗皮、佐藥余甘子、使藥蒺藜組成，具有清熱、利尿等功效，用于尿道炎、尿頻、尿急等癥[1]，是藏醫治療“尿頻癥”的復方制劑，另還用于“京尼薩庫病”（屬于糖尿病范疇）的治療[2]。四味姜黃湯散收錄于《中華人民共和國衛生部藥品標準：藏藥》（第一冊）[3]，其中僅有性狀描述，未見含量控制項，難以保障藏醫臨床用藥的有效性。目前有采用高效液相色譜法（HPLC）測定其單一成分[1，4]、4種成分（木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿）[5]和3種成分（鹽酸小檗堿、槲皮素、姜黃素）[6]控制其質量的文獻報道。由于藏藥復方成分復雜，成分間可發生相互作用，因此僅控制其中少數成分含量，很難全面反映其質量[7]。鑒于此，本文采用HPLC法同時測定該制劑中姜黃的有效成分姜黃素[8]，小檗皮的有效成分木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿[9-10]，余甘子的有效成分沒食子酸、鞣花酸[11]的含量，以期為完善該制劑的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1311B型四元泵、內置真空脫氣機、G1329B型標準自動進樣器、G1315D型二極管陣列檢測器、G1316A柱溫箱、Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）；BSA124S型萬分之一、CPA225D型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UPH-I-10T型優普純水制造系統（成都超純科技有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

姜黃藥材（批號：20151101）、余甘子藥材（批號：20151101）、蒺藜藥材（批號：20151101）均購自成都市國際商貿城藥材市場，小檗皮藥材（批號：20141201）由西藏甘露藏藥廠提供，均經成都中醫藥大學賴先榮、范剛副研究員鑒定為姜科植物姜黃Curcuma Longa L. 的干燥根莖、大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L的干燥成熟果實、蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L. 的干燥成熟果實、為小檗科小檗屬植物刺紅珠Berberis kansuensis schneid的干燥根莖。按姜黃15 g、小檗皮12.5 g、余甘子25 g和蒺藜25 g的處方比例，制成粗粉，過篩，混勻，即得3批樣品（批號分別為20151101、20151102、20151103）。

沒食子酸（批號：110831-201204，含量：以89.9%計）、鹽酸藥根堿（批號：110733-201108，含量：以90.3%計）、鹽酸巴馬?。ㄅ枺?10732-201309，含量：以86.6%計）、鹽酸小檗堿（批號：110713-201212，含量：以86.7%計）、姜黃素（批號：110823-201004，含量：以98.8%計）均購于中國食品藥品檢定研究院；木蘭花堿（批號：MUST-14122416，含量：以99.77%計）、鞣花酸（批號：MUST-16062603，含量：以99.65%計）均購于四川賽因斯特生物科技有限公司；磷酸、乙腈為色譜純，甲醇、鹽酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell Pak C18-MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，3%A；8～15 min，3%→17%A；15～20 min，17%A；20～33 min，17%→19%A；33～38 min，19%→25%A；38～48 min，25%A；48～70 min，25%→80%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：270 nm（0～60 min，沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿）和428 nm（60～70 min，姜黃素）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和姜黃素對照品12.48、14.20、3.78、1.18、0.80、4.91、3.02 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并定容，搖勻，制成沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和姜黃素質量濃度分別為1.248、1.420、0.378、0.118、0.080、0.491、0.302 mg/mL的單一對照品貯備液。再分別取上述單一對照品貯備液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。用錫箔紙將配好的量瓶包好，冷藏于冰箱中（4 ℃），備用。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入90%甲醇-鹽酸溶液（100 ∶ 2，V/V）50 mL，搖勻，稱定質量，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）處理20 min，冷卻至室溫；再次稱定質量，用鹽酸-90%甲醇溶液（2 ∶ 100，V/V）補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，經0.45 ?m微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 空白溶液 取流動相適量作為空白溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果，在該色譜條件下，各待測成分間、待測成分與雜質峰間均能達到基線分離，分離度>1.5，其他成分對待測成分的測定無干擾，理論板數以沒食子酸峰計>5 000，詳見圖1。

2.4 線性關系考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10、12 ?L，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量為橫坐標（x，?g）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，線性關系考察結果見表1。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當

信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限；當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限。結果，沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和姜黃素的檢測限分別為6.24、4.73、7.56、2.36、3.20、6.54、6.04 ng，定量限分別為17.47、16.08、20.86、7.31、10.24、19.62、19.32 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，每次10 ?L，記錄峰面積。結果，沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和姜黃素峰面積的RSD分別為0.21%、0.18%、0.36%、0.06%、0.89%、0.13%、0.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20151101），分別于室溫下放置2、4、6、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和姜黃素峰面積的RSD分別為1.93%、0.70%、1.69%、1.04%、1.12%、0.75%、1.08%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：20151101）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和姜黃素峰面積的RSD分別為1.69%、0.78%、1.57%、1.76%、0.94%、0.84%、1.15%（n=6），含量的平均值分別為7.518 8、13.914 3、3.721 3、0.990 3、0.706 5、4.387 8、3.787 4 mg/g，表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品（批號：20151101）適量，共9份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，各加入低、中、高質量的待測成分對照品，再按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表3。

3 討論

3.1 檢測指標的選擇

藥效研究結果表明[12]，姜黃素可顯著改善鏈脲佐菌素（STZ）誘導糖尿病大鼠的糖代謝紊亂，降低STZ誘導糖尿病腎病的腎臟肥大指數，防止糖尿病腎病腎纖維化，增加機體抗氧化酶活性等作用。木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對糖尿病及其并發癥具有顯著的降糖效果，對糖尿病大鼠視網膜損傷有保護作用[2]。沒食子酸、鞣花酸具有顯著的降血糖作用[13-14]。上述7種成分均具有與該復方制劑功能相關的藥理活性，因此選取上述成分作為四味姜黃湯散質量控制的指標。

3.2 供試品溶液制備條件考察

3.2.1 提取溶劑中甲醇濃度以及與鹽酸的體積比 筆者分別以50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇-鹽酸（100 ∶ 1，100 ∶ 2，100 ∶ 3，V/V）溶液為提取溶劑，考察提取效果。結果發現甲醇濃度為90%時，90%甲醇與鹽酸體積之比為100 ∶ 2，對供試品溶液中主要成分的提取效果較好且峰型較好，因此選擇90%為提取溶劑中甲醇的濃度，90%甲醇與鹽酸體積之比為100 ∶ 2。

3.2.2 提取溶劑用量 筆者以90%甲醇-鹽酸溶液（100 ∶ 2，V/V）作為提取溶劑，考察其用量為25、50、100、200、500 mL的色譜峰情況。結果發現當提取溶劑用量為50 mL時，待測成分的色譜峰響應度適中，故確定提取溶劑用量為50 mL。

3.2.3 提取時間 筆者以50 mL 90%甲醇-鹽酸溶液（100 ∶ 2，V/V），分別考察超聲時間為10、20、30、40 min的提取效果，結果發現超聲處理20 min時可以將待測成分提取完全，故確定超聲時間為20 min。

3.3 色譜條件的選擇

3.3.1 流速 筆者分別考察了流速為0.8、1.0 mL/min時對7種待測成分的分離情況，結果發現由于1.0 mL/min的流速過快，待測成分之間不能得到很好的分離，而流速為0.8 mL/min時可使待測成分之間分離更好，因此最終確定流速為0.8 mL/min。

3.3.2 流動相組成 筆者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.1%三乙胺溶液[15]為流動相進行梯度洗脫時的色譜情況。結果發現，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，待測成分間分離良好。

3.3.3 檢測波長 筆者參考相關文獻[16]，采用二級管陣列檢測器在200～430 nm波長范圍內對供試品溶液進行全波長掃描，結果發現沒食子酸、鞣花酸、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿在270 nm，姜黃素在428 nm波長處，紫外吸收較好，且待測成分互不干擾。因此，選擇波長切換法測定上述7種成分的含量，結果表明各待測成分響應信號穩定。

3.4 含量測定結果分析

姜黃素、鹽酸小檗堿、沒食子酸分別為姜黃、小檗皮、余甘子中的主要有效成分，這3種成分均具有顯著的降血糖作用。在樣品含量測定結果中上述3種主要有效成分的平均含量分別為3.789 0、4.678 0、7.648 2 mg/g。由于制劑含量測定的結果可能與原料藥材的來源、質量、貯藏等多種因素有關，參考相關文獻[4，6]，筆者建議將姜黃素、鹽酸小檗堿、沒食子酸3種成分作為四味姜黃湯散的主要檢測指標，暫定制劑中上述3種成分的含量測定限度分別為每1 g湯散不低于3.0、3.5、6.0 mg（按平均含量下浮20%）為宜。

綜上所述，本研究建立的方法操作簡便，結果準確可靠，適用于四味姜黃湯散中沒食子酸、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和姜黃素含量的同時測定。

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（收稿日期：2017-07-23 修回日期：2017-08-14）

（編輯：劉 柳）