澤瀉多糖對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及脂代謝紊亂的改善作用及機制研究

張明麗　陳吉全　周新強

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）01-0042-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.11

摘 要 目的：考察澤瀉多糖對2型糖尿病（T2DM）大鼠胰島素抵抗及脂代謝紊亂的影響及可能機制。方法：采用高脂飲食飼養聯合腹腔注射鏈脲佐菌素（30 mg/kg）法建立T2DM大鼠模型。將造模成功的50只大鼠隨機分為模型組（生理鹽水）、格列本脲組（陽性對照，25 mg/kg）和澤瀉多糖高、中、低劑量組（400、200、100 mg/kg），每組10只；另選10只正常大鼠作為正常對照組（生理鹽水）。各組均灌胃給藥，每天1次，連續6周。給藥5周后進行糖耐量實驗，分別檢測腹腔注射2 g/kg葡萄糖溶液后0、30、60、90、120 min大鼠空腹血糖（FBG）水平。給藥6周后，檢測大鼠血清中空腹胰島素（FINS）、FBG水平并計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）和胰島素敏感指數（ISI）；檢測大鼠血清中游離脂肪酸（FFA）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）水平和肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）水平。結果：與正常對照組比較，糖耐量實驗中，模型組大鼠0～120 min的FBG水平均升高；給藥6周后，模型組大鼠血清中FINS、LDL-C水平和ISI以及肝組織中SOD、GSH-Px水平均降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，除澤瀉多糖低劑量組大鼠HOMA-IR和血清中LDL-C、HDL-C水平改善不顯著外（P>0.05），其余各給藥組大鼠各指標均顯著改善（P<0.05）。結論：澤瀉多糖可能通過抗氧化作用來改善T2DM大鼠胰島素抵抗及脂代謝紊亂。

關鍵詞 澤瀉多糖；2型糖尿病；胰島素抵抗；脂代謝；抗氧化；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE：To investigate the effects of Alisma orientalis polysaccharides on the insulin resistance and lipid metabolism disorder in type 2 diabetes mellitus （T2DM） rats and its possible mechanism. METHODS： T2DM rat model was induced by high fat diet combined with intraperitoneal injection of streptozotocin （30 mg/kg）. 50 model rats were randomly divided into model group （normal saline）， glibenclamide group （positive control， 25 mg/kg） and A. orientalis polysaccharide high-dose， medium-dose and low-dose groups （400， 200， 100 mg/kg）， with 10 rats in each group. Other 10 normal rats were included in normal control group （normal saline）. All groups were given drugs ig， once a day， for consecutive 6 weeks. After 5 weeks of administration， the glucose tolerance test was conducted. Fasting blood glucose （FBG） levels were measured in rats 0， 30， 60， 90， 120 min after intraperitoneal injection of 2 g/kg Glucose solution， respectively. After 6 weeks of administration， serum levels of FINS and FBG were measured， and HOMA-IR and insulin sensitivity index （ISI） were calculated； serum levels of FFA， LDL-C， HDL-C， TG and TC were detected， and the levels of SOD， GSH-Px and MDA in liver tissue were detected. RESULTS： Compared with normal control group， FBG levels of rats in model group at 0-120 min were increased significantly in glucose tolerance test. After 6 weeks of administration， the serum levels of FINS， LDL-C and ISI， and the levels of SOD and GSH-Px in the liver tissue of the model group were decreased， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with model group， each index of other administration group were improved significantly （P<0.05）， except that HOMA-IR， the serum levels of LDL-C and HDL-C were not significantly improved in A. orientalis polysaccharide low-dose group （P>0.05）. CONCLUSIONS： A. orientalis polysaccharide can improve insulin resistance and lipid metabolism disorder in T2DM rats through antioxidant effect.

KEYWORDS Alisma orientalis polysaccharides； Type 2 diabetes mellitus； Insulin resistance； Lipid metabolism； Antioxidant； Rat

澤瀉為傳統中藥材，為澤瀉科植物澤瀉[Alisma orientalis （Sam.） Juzep.]的干燥塊莖，性寒，味甘、淡，歸膀胱、腎經，具有化濁降脂、泄熱、利水滲濕等功效，臨床上主要用于治療熱淋澀痛、痰飲眩暈、泄瀉尿少、水腫脹滿、小便不利等癥[1]。現代藥學研究表明，澤瀉的主要活性成分為多糖、三萜、倍半萜、二萜、揮發油、生物堿、黃酮等，具有抗脂肪肝、降血脂、降血壓、利尿、抗動脈粥樣硬化等藥理作用[2]。另有研究發現，澤瀉單味中藥可以降低糖尿病大鼠血糖及改善糖耐量異常，澤瀉水提醇沉物也可以通過促進胰島素釋放發揮降血糖作用[3-4]。鑒于傳統中醫藥多以水煎劑服用，而多糖為主要的水溶性成分之一[5]；同時由于胰島素抵抗及脂代謝紊亂在糖尿病進程中的關鍵作用[6]，本研究將以澤瀉多糖（AOP）為研究對象，著重探討其對2型糖尿病（T2DM）大鼠胰島素抵抗及脂代謝紊亂的影響及可能機制，為將來深度開發以AOP為主要成分的抗糖尿病藥奠定實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

Microfuge 20R型高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；卓越型血糖儀（瑞士羅氏公司）；7150型全自動生化分析儀（日本日立公司）；GC-1200γ型放免計數儀（合肥中佳光電儀器公司）；HBS-1096A型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

AOP參考文獻[7]中方法由本實驗室自制，經測定其含量為83.42%；格列本脲片（山西云鵬制藥有限公司，批號：20141104，規格：每片2.5 mg）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，批號：110610）；空腹胰島素（FINS）、游離脂肪酸（FFA）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）檢測試劑盒均購于南京建成生物公司；其余試劑均為國產分析純。

1.3 動物

健康SPF級SD大鼠90只，♂，8周齡，購于河南大學實驗動物中心，動物生產合格證號：SCXK（豫）2015- 0004。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將SD大鼠隨機分為兩組，一組為正常對照組，10只，喂食常規飼料；另一組為高脂飲食組，80只，喂食高脂飼料（66.5%常規飼料+20%蔗糖+10%豬油+2.5%膽固醇+1%膽酸鹽）。飼養8周后，高脂飲食組大鼠腹腔注射30 mg/kg的STZ，72 h后尾靜脈取血，當空腹血糖（FBG）≥16.7 mmol/L時視為建模成功。在58只建模成功的大鼠中選出50只，隨機分為模型組、格列本脲組（陽性對照）和AOP高、中、低劑量組，每組10只。參照文獻[8]中給藥劑量并結合預實驗結果，AOP高、中、低劑量組大鼠灌胃400、200、100 mg/kg的AOP，格列本脲組大鼠灌胃25 mg/kg的格列苯脲，模型組和正常對照組大鼠均給予等體積的生理鹽水，每天給藥1次，連續給藥6周。給藥期間，除正常對照組外的其余大鼠均喂食高脂飼料。觀察各組大鼠的一般狀況。

2.2 糖耐量實驗

在給藥5周后，各組大鼠均禁食12 h，腹腔注射2 g/kg的葡萄糖溶液，分別在注射第0、30、60、90、120 min時尾靜脈取血，離心分離血清，采用葡萄糖氧化酶法測定血糖水平，考察AOP對T2DM大鼠糖耐量的影響。

2.3 胰島素抵抗相關指標檢測

在給藥6周后，所有大鼠禁食12 h，10%水合氯醛麻醉。采用心臟穿刺法采血，離心后分離血清，分裝于1.5 mL離心管中，-80 ℃低溫冰箱儲存，備用。采用放射免疫法及葡萄糖氧化酶法分別測定FINS、FBG水平（具體操作按照相應試劑盒說明書進行），并按下列公示計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）、胰島素敏感指數（ISI）：HOMA-IR=FBG×FINS/22.5，ISI=ln（FBG×FINS）-1。

2.4 FFA、LDL-C、HDL-C、TG、TC水平檢測

取“2.3”中分離的血清，采用改良比色法測定血清FFA水平，采用酶聯免疫吸附法測定血清LDL-C、HDL- C、TG和TC水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2.5 SOD、GSH-Px、MDA水平檢測

采血結束后，處死大鼠，分離肝組織，并用預冷的生理鹽水反復沖洗表面殘留血跡，濾紙吸干，稱肝質量。取適量肝組織，按1 ∶ 10的比例加入預冷的生理鹽水，制備肝組織勻漿液，在4 ℃條件下以3 000×g離心10 min后取上清。按照試劑盒說明書方法操作，檢測各組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px、MDA水平。

2.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件對所得數據進行統計分析。數據以x±s表示，采用單因素方差分析進行多組間數據比較，兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般狀態

在實驗過程中，正常對照組大鼠毛色光滑，進食量及大小便正常，狀態良好，體質量增加明顯；腹腔注射STZ 1周后，模型組大鼠開始出現脫毛且毛色變枯黃，進食量、飲水量及尿量均顯著增加，反應遲鈍，體形消瘦；格列苯脲組和AOP高劑量組大鼠從給藥第3周開始，AOP中、低劑量組大鼠從給藥第4周開始，同模型組比較，大鼠狀態明顯改善，且體質量水平有一定程度的升高。

3.2 大鼠葡萄糖耐量

模型組大鼠FBG水平下降緩慢，在120 min內一直維持在較高水平。在各時間點，模型組大鼠FBG水平均明顯高于正常對照組（P<0.05）；格列苯脲組和AOP高、中、低劑量組大鼠在0、30、60、90、120 min 5個時間點的FBG水平均明顯低于模型組（P<0.05），結果見表1。

3.3 大鼠血清FBG、FINS水平和HOMA- IR、ISI

與正常對照組比較，模型組大鼠FBG水平、HOMA- IR顯著升高，FINS水平、ISI顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠FBG水平、HOMA-IR指數均顯著降低（P<0.05），FINS水平顯著升高（P<0.05）；格列本脲組和AOP高、中劑量組大鼠ISI顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05），結果見表2。

3.4 大鼠脂代謝相關指標

與正常對照組比較，模型組大鼠血清HDL-C水平顯著降低，FFA、LDL-C、TG和TC水平均顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清FFA、TG和TC水平均顯著降低；格列苯脲組及AOP高、中劑量組大鼠血清LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高，差異具有統計學意義，結果見表3。

3.5 大鼠抗氧化指標

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織MDA水平顯著增加，而SOD、GSH-Px水平則顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織MDA水平顯著降低，SOD、GSH-Px水平顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05），結果見表4。

4 討論

胰島素抵抗是指胰島素促進葡萄糖攝取和利用的能力下降，表現為靶器官對一定劑量的胰島素所產生的生理效應低于正常水平的一種狀態，胰島素抵抗是T2DM發病的主要機制和始動因素[9]。在T2DM患者中，胰島素抵抗的發生率超過80%[10]，因此，改善T2DM患者的胰島素抵抗狀態，是治療T2DM的有效途徑。ISHOMA-IR和ISI是評價胰島素抵抗的兩個重要指標，當胰島素抵抗發生時，ISHOMA-IR升高、ISI降低。本研究發現，AOP可以使T2DM大鼠HOMA-IR降低、ISI升高，提示AOP具有改善T2DM大鼠胰島素抵抗的作用。血脂代謝紊亂可以對胰島信號激活產生不利影響，是胰島素抵抗產生的一個重要原因，而FFA、TG、TC、LDL- C、HDL-C等是評價血脂代謝是否正常的主要指標。FFA可以促進胰島素受體底物1在絲氨酸位置處發生磷酸化反應，抑制胰島素信號通路的活化，最終導致葡萄糖轉運蛋白4的表達減少，從而引起胰島素抵抗[11]。此外，相關研究表明，TG、TC、LDL-C水平的升高及HDL- C水平的降低，除了可以加劇胰島素抵抗程度外，還可以引起β細胞內脂類過量堆積，使β細胞功能受損，進而加劇胰島素抵抗程度[12]。本研究發現，AOP可以降低T2DM大鼠FFA、TG、TC及LDL-C水平，升高HDL-C水平，提示AOP具有調節T2DM大鼠血脂代謝紊亂的作用。

氧化應激可以促進胰島素抵抗的發生及進一步加劇血脂代謝紊亂[13]。研究表明，氧自由基可作用于轉錄因子的激活、細胞內鈣離子穩態、蛋白質磷酸化及其級聯的信號轉導等多個過程，調控信號通路，引起胰島素抵抗；反過來，胰島素抵抗又可以加重氧化應激水平[14]。氧化應激與脂代謝之間存在交互作用，脂代謝水平增加可以導致耗氧量升高，使活性氧簇（ROS）大量產生；過量的ROS又會引起脂肪、蛋白質等大分子變性，從而造成肝、胰腺等組織受損，反過來影響脂代謝，發生脂代謝紊亂[15]。SOD、GSH-Px及MDA是反映機體氧化應激水平的主要指標，SOD、GSH-Px為體內抗氧化防御系統的重要組成部分，而MDA水平的高低直接反映了機體氧化應激水平的嚴重程度[16]。本研究發現，AOP可以升高SOD、GSH-Px水平，降低MDA水平，這提示AOP具有抗氧化作用，這可能是其改善T2DM大鼠胰島素抵抗及脂代謝紊亂的作用機制。

綜上所述，AOP具有改善T2DM大鼠胰島素抵抗及脂代謝紊亂作用，該作用可能與AOP具有抗氧化作用有關，而具體的作用機制還有待深入研究。

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（收稿日期：2017-05-22 修回日期：2017-08-17）

（編輯：林 靜）