芬戈莫德對腎缺血再灌注損傷模型小鼠的腎保護作用及其機制研究

黃倩　梁青龍　陳慧勤　王梅愛　黃秋虹　鄭丹丹　林佩璜

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）01-0054-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.14

摘 要 目的：研究芬戈莫德對腎缺血再灌注損傷（RIRI）模型小鼠的腎保護作用及其機制。方法：將60只小鼠隨機分為假手術組、模型組、芬戈莫德組（1 mg/kg）和芬戈莫德+wortmannin組[芬戈莫德1 mg/kg+磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）特異性阻滯藥wortmannin 1.4 mg/kg]，每組15只。除假手術組外，其余3組小鼠均建立RIRI模型，術前24 h一次性經(jīng)尾靜脈注射相應的藥物。再灌注24 h后收集每組小鼠血清，使用全自動生化分析儀測量各組小鼠血清中血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平；光鏡下觀察腎組織病理變化；Western blot法檢測腎組織中細胞間黏附分子1（ICAM-1）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白的表達。結果：與假手術組比較，模型組小鼠血清中Scr和BUN水平明顯升高（P<0.01）；腎組織出現(xiàn)病理性改變，腎小管上皮細胞壞死，炎性細胞浸潤；腎組織中ICAM-1和MCP-1蛋白表達水平明顯升高（P<0.01），p-Akt蛋白表達水平輕微升高（P>0.05）。與模型組比較，芬戈莫德組小鼠除腎組織中p-Akt蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）外，其余指標均明顯改善（P<0.01）。與芬戈莫德組比較，芬戈莫德+wortmannin組小鼠的上述指標變化均逆轉（P<0.05或P<0.01）。結論：芬戈莫德能減輕RIRI模型小鼠的腎損傷，其機制可能與激活PI3K/Akt信號通路有關。

關鍵詞 芬戈莫德；腎缺血再灌注損傷；小鼠；磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白激酶B

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effect of fingolimod on renal ischemia reperfusion injury （RIRI） model mice and its mechanism. METHODS： A total of 60 mice were randomly divided into sham operation group， model group， fingolimod group （1 mg/kg） and fingolimod+wortmannin group [fingolimod 1 mg/kg+phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K） specific blocker wortmannin 1.4 mg/kg]， with 15 mice in each group. Except for sham operation group， RIRI model was induced in other 3 groups， and those model mice were given relevant medicine via caudal vein at once 24 h before surgery. Serum of mice were collected in each group after 24 h perfusion. Serum levels of Scr and BUN were measured by automatic biochemical analyzer. The pathological changes of renal tissue were observed under light microscope. The protein expression of intercellular cell adhesion molecule-1 （ICAM-1）， monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1） and phosphorylated protein kinase B （p-Akt） in renal tissue were measured by Western blot assay. RESULTS： Compared with sham operation group， the serum levels of Scr and BUN in model group were increased significantly （P<0.01）. Pathological changes were found in the kidney， and RIRI led to widespread renal tubular epithelial cell injury， apoptosis and inflammatory cells infiltration. The protein expression of ICAM-1 and MCP-1 in renal tissue were increased significantly （P<0.01）， the protein expression of p-Akt was increased slightly （P>0.05）. Compared with mo- del group， other indexes of fingolimod group were improved significantly （P<0.01） except that the protein expression of p-Akt in renal tissue was increased significantly （P<0.01）. Compared with fingolimod group， above indexes of fingolimod+wortmannin group were reversed （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Fingolimod can obviously ameliorate renal injury induced by RIRI in mice， the mechanism of which may be associated with the activation of PI3K/Akt signaling pathway.

KEYWORDS Fingolimod； Renal ischemia reperfusion injury； Mice； Phosphatidylinositol 3-kinase； Phosphorylated protein kinase B

腎缺血再灌注損傷（RIRI）是臨床常見的病理過程，如處理不及時可能使多個臟器受累。雖然關于RIRI的發(fā)生機制目前尚未完全闡明，但眾所周知炎癥反應是RIRI發(fā)生的重要機制[1]，其中細胞黏附分子和細胞因子是RIRI過程中導致腎臟炎癥和腎臟組織損傷的關鍵環(huán)節(jié)[2]。RIRI后炎癥細胞浸潤，促炎癥細胞因子大量合成[3]，而促炎癥細胞因子又可間接誘導細胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管內皮細胞黏附分子1（VCAM-1）及巨噬細胞炎癥蛋白2（MIP-2）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）等的產(chǎn)生[4]，最終引發(fā)炎癥級聯(lián)反應。因此，抑制RIRI后的炎癥反應，降低細胞黏附分子和細胞因子的表達，是缺血性腎損傷的一種新型治療途徑。

芬戈莫德是一種源自冬蟲夏草的活性成分，再經(jīng)化學修飾后合成的一種特異性免疫抑制劑[5]，主要用于器官移植[6]、自身免疫性疾病[7]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8]等的治療。近年來發(fā)現(xiàn)其可通過激活1-磷酸鞘氨醇（S1P）受體發(fā)揮抗炎作用和器官保護作用，成為備受關注的新型抗炎劑[9]。已有研究將芬戈莫德應用于RIRI，發(fā)現(xiàn)其可抑制相應的組織浸潤、減輕炎癥反應[10]。此外，芬戈莫德還能抑制IRI條件下淋巴細胞浸潤、降低血管通透性[11]。雖然有研究顯示，芬戈莫德具有腎臟保護作用，可減輕RIRI，但其具體機制尚未完全闡明。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路在RIRI中起著非常重要的調控作用[12]。本研究通過建立RIRI小鼠模型，觀察芬戈莫德對RIRI后腎功能、炎癥因子和磷酸化Akt（p-Akt）的影響，以及PI3K特異性阻滯藥wortmannin對芬戈莫德上述作用的影響，探究芬戈莫德對RIRI的保護作用及其機制，期望為臨床治療缺血性腎損傷尋求新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

680型酶標儀（美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）；凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；光學顯微鏡（重慶光學儀器廠）；ULTRACUT-R型超薄切片機（德國Leica公司）；GT10-1型高速臺式離心機（上海京工實業(yè)有限公司，離心半徑：9.8 cm）；全自動生化分析儀（上海恒盛醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

芬戈莫德原料藥（美國Cayman公司，批號：CAS- 162359-56-0，純度：99%）； wortmannin（美國Sigma公司，批號：W1628，純度：≥98%）； ICAM-1抗體、MCP-1抗體、p-Akt抗體、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（英國Abcam公司，批號：ab33894、ab151538、ab81283、ab8227）；辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.3 動物

健康成年C57BL/6小鼠60只，♂，選用8～12周齡，清潔級，體質量22～25 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007-0005，使用許可證號：SYXK（滬）2007-0005。標準條件飼養(yǎng)，自由進食、飲水，適宜溫度、濕度，人工黑暗和光照交替。

2 方法

2.1 分組、建模與給藥

選用小鼠60只，適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為假手術組、模型組、芬戈莫德組（1 mg/kg）[13]和芬戈莫德+wortmannin組[芬戈莫德1 mg/kg+wortmannin 1.4 mg/kg[14]]，每組15只，除假手術組外，其余3組小鼠均建立RIRI模型。建模方法[15]如下：小鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，取腹正中線做切口，暴露并游離出雙側腎的腎蒂；以無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側腎蒂，45 min后去除動脈夾再進行灌注，恢復血流再灌注24 h。若術中小鼠腎組織由紫黑色轉為紅潤，且術后3 h內小鼠恢復清醒則表示灌注成功，否則灌注失敗。假手術組小鼠只接受麻醉、開腹、分離雙側腎蒂，不予夾閉腎蒂，45 min后關閉腹腔。芬戈莫德組和芬戈莫德+wortmannin組小鼠在缺血前24 h尾靜脈注射相應藥物，假手術組和模型組小鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水，均一次性給藥。各組小鼠再灌注24 h后，下腔靜脈取血用于腎功能檢測，然后處死小鼠并取出雙側腎，一側腎用于病理組織學檢查，另一側腎迅速放入液氮冷卻后置于超低溫冰箱中凍存用于后續(xù)蛋白定量檢測。

2.2 一般參數(shù)檢測

各組小鼠再灌注24 h后，麻醉、下腔靜脈取血，室溫下靜置1 h，4 ℃下3 000×g離心15 min，收集血清，使用全自動生化分析儀測量血清中血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平。

2.3 腎病理組織學檢查

各組小鼠取血后，處死，迅速取出腎，用預冷生理鹽水洗凈殘留血液，置于4%多聚甲醛液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（約3 μm厚）、蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

2.4 腎組織中ICAM-1、MCP-1和p-Akt蛋白表達水平檢測

采用Western blot法，取各組小鼠腎組織置入手動玻璃勻漿器勻漿，按1 ∶ 10（20 mg/200 μL）加入預冷的組織裂解液，充分裂解后，4 ℃下10 000×g離心5 min，小心吸取上清，提取腎中總蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合后煮沸5 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維膜，采用5%脫脂奶粉4 ℃封閉2 h，分別加入ICAM-1抗體（1 ∶ 100）、MCP-1抗體（1 ∶ 100）、p-Akt抗體（1 ∶ 500）混合，于4 ℃孵育過夜。洗膜后與HRP標記二抗混合，室溫下孵育2 h，采用增強化學發(fā)光（ECL）顯影、定影，以目的蛋白與內參β-actin的光密度比值作為目的蛋白的相對表達量。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用x±s表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 一般參數(shù)

與假手術組比較，模型組小鼠血清中Scr和BUN水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，芬戈莫德組小鼠血清中Scr和BUN水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與芬戈莫德組比較，芬戈莫德+wortmannin組小鼠血清中Scr和BUN水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），但仍低于模型組。各組小鼠血清中Scr和BUN水平比較見表1。

3.2 腎病理組織學變化

光學顯微鏡下，假手術組小鼠腎組織結構未見異常；模型組小鼠腎組織中幾乎所有的腎小管上皮細胞壞死、脫落，腎小管管腔明顯擴張，管腔中可見管型，間質充血與炎癥細胞浸潤；芬戈莫德組小鼠腎小管上皮細胞腫脹、壞死、脫落程度比模型組輕，有少許炎癥細胞浸潤，不見管型；芬戈莫德+wortmannin組小鼠腎小管管腔擴張，可見少許管型，有炎癥細胞浸潤。各組小鼠腎組織的病理切片圖見圖1。

3.3 腎組織中ICAM-1、MCP-1和p-Akt蛋白表達水平

與假手術組比較，模型組小鼠腎組織中ICAM-1和MCP-1蛋白表達水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），p-Akt蛋白表達水平有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組比較，芬戈莫德組小鼠腎組織中ICAM-1和MCP-1蛋白表達水平均明顯降低，p-Akt蛋白表達水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與芬戈莫德組比較，芬戈莫德+wortmannin組小鼠腎組織中ICAM-1和MCP-1蛋白表達水平均明顯升高，p-Akt蛋白表達水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠腎組織中ICAM-1、MCP-1和p-Akt蛋白表達的電泳圖見圖2，定量分析結果見表2。

4 討論

IRI是住院患者常見的臨床病理現(xiàn)象，機制復雜，其中再灌注過程中細胞黏附分子和細胞因子釋放增多可能發(fā)揮著重要作用[16]。因此，尋找有效的干預手段阻斷炎癥反應是減輕RIRI的有效途徑之一。本研究在建立小鼠RIRI模型的基礎上，觀察了ICAM和MCP-1的表達與再灌注損傷的關系，以及芬戈莫德對再灌注損傷的影響。本研究結果顯示，小鼠RIRI后腎組織發(fā)生了顯著的病理變化，腎小管上皮細胞壞死、脫落，腎小管管腔明顯擴張，間質明顯炎癥細胞浸潤，血清中Scr和BUN顯著升高。但如果于缺血前24 h靜脈注射芬戈莫德，RIRI程度明顯改善，且血清中Scr和BUN水平明顯降低，表明芬戈莫德對RIRI有保護作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，小鼠缺血45 min再灌注24 h后腎組織中ICAM和MCP-1蛋白水平明顯升高，表明ICAM和MCP-1與RIRI密切相關。并且芬戈莫德的這種效應可被wortmannin部分阻斷，這提示芬戈莫德可能通過激活PI3K信號通路減輕小鼠RIRI后的炎癥反應發(fā)揮腎臟保護作用。

Akt屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，其激活通常要依賴上游PI3K的活化而使Akt發(fā)生磷酸化。PI3K/Akt信號通路參與調節(jié)細胞凋亡、增生和分化等一系列生理活動，而Akt激活起關鍵性作用[17]。有關PI3K/Akt信號通路在RIRI中的調控機制研究報道尚不多見，有研究報道在IRI的小鼠腎組織中，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路被活化，可能影響腎小管上皮細胞的生存，在急性缺血性腎損傷中發(fā)揮著非常重要的調控作用[12]。有研究證實，鞘氨醇-1-磷酸（S1P）與S1P受體結合后通過激活PI3K/Akt信號通路，使細胞內p-Akt水平升高，進而減輕IRI[18]。本研究以腎IRI模型為研究對象，采用Western blot法檢測腎組織內p-Akt水平，旨在探索S1P受體激動劑芬戈莫德能否通過非PI3K依賴的信號通路激活Akt。結果表明，腎IRI能輕度激活Akt，但差異無統(tǒng)計學意義，這與袁磊等[19]研究結果相似；給予芬戈莫德處理后能顯著提高IRI腎組織中p-Akt水平，這提示在芬戈莫德所介導的腎保護作用機制中Akt可能扮演著關鍵角色。然而，當加入PI3K抑制劑wortmannin后，PI3K被抑制，PI3K下游分子Akt的活化也被其抑制，但p-Akt水平仍較模型組高，這提示芬戈莫德對Akt的活化僅被wortmannin部分阻斷，芬戈莫德還可能通過非PI3K依賴的信號通路激活Akt。

綜上所述，本研究結果顯示，芬戈莫德能夠明顯抑制RIRI后腎組織損傷，這可能是由于芬戈莫德激活了PI3K/Akt信號通路，進而減輕炎癥反應，最終發(fā)揮腎保護作用所致。本研究結果可為芬戈莫德臨床治療缺血性腎損傷提供理論和實驗基礎。

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（收稿日期：2017-07-06 修回日期：2017-08-21）

（編輯：鄒麗娟）