分子對接技術(shù)篩選黑沙蒿中黃酮類化合物的PPAR—γ激動(dòng)活性成分

肖音　肖斌　趙娜　張娜　武心亮　蘇伊新

中圖分類號 R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）01-0058-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.15

摘 要 目的：從黑沙蒿所含黃酮類化合物中篩選過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）的激動(dòng)活性成分，為發(fā)現(xiàn)黑沙蒿中抗糖尿病藥效物質(zhì)提供參考。方法：以已知PPAR-γ激動(dòng)藥羅格列酮為陽性對照，采用分子對接技術(shù)對黑沙蒿中已分離得到的18個(gè)黃酮類化合物與PPAR-γ靶點(diǎn)進(jìn)行一一分子對接，并對化合物與PPAR-γ靶點(diǎn)的對接親和力、對接構(gòu)象等進(jìn)行分析比較，篩選黑沙蒿中可能的PPAR-γ激動(dòng)活性成分。結(jié)果：有5個(gè)黃酮類化合物呈現(xiàn)了較好的對接親和力，其中以化合物3（5，3′ ，4′ -三羥基-7-甲氧基黃酮）親和力最高（-8.3 kcal/mol）；對接構(gòu)象分析發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物A環(huán)與B環(huán)上的氧原子易與PPAR-γ配體結(jié)合域活性位點(diǎn)形成1個(gè)（Tyr327）或2個(gè)（Tyr327、Arg288）氫鍵結(jié)合，這對于黃酮類化合物與PPAR-γ的結(jié)合以及PPAR-γ構(gòu)象的穩(wěn)定起著重要作用。結(jié)論：采用分子對接技術(shù)進(jìn)行的虛擬篩選結(jié)果表明，黑沙蒿中的黃酮類化合物（大多含有多個(gè)自由酚羥基）易與PPAR-γ形成較好的對接模式與較高親和力，具有潛在抗糖尿病活性；本研究可為黑沙蒿治療2型糖尿病的化學(xué)成分研究提供參考。

關(guān)鍵詞 黑沙蒿；分子對接技術(shù)；黃酮類化合物；過氧化物酶體增殖物激活受體-γ；親和力；抗糖尿病

ABSTRACT OBJECTIVE： To screen the agonist active ingredients of peroxisome proliferator-activated receptor-γ （PPAR-γ） in flavonoids from Artemisia ordosica， and provide reference for finding antidiabetic agents in A. ordosica. METHODS： Using known PPAR-γ agonist rosiglitazone as positive control， molecular docking technology was conducted for docking one by one for 18 flavonoids and PPAR-γ targets obtained from A. ordosica. It was compared with binding affinities and binding modes of compounds and PPAR-γ targets， and the possible PPAR-γ agonist ingredients in A. ordosica were screened. RESULTS： 5 flavonoids showed good docking affinities， in which， compound 3 （5，3′ ，4′ -trihydroxy-7-methoxyflavone） showed the highest （-8.3 kcal/mol）. Docking mode analysis showed that the phenol oxygen on ring A and ring B of the flavonoids with LBD active site of PPAR-γ formed one （Tyr327） or two hydrogen bonding （Tyr327， Arg288）， which played an important role in the binding of flavonoids and PPAR-γ and the stability of PPAR-γ conformation. CONCLUSIONS： Results of virtual screening in molecular docking technology indicate that flavonoids （mostly containing multiple free phenolic hydroxyl groups） in can easily form good docking mode and high affinity with PPAR-γ， showing potential antidiabetic activity. The study can provide reference for further research of chemical ingredients for the treatment of type 2 diabetes.

KEYWORDS Artemisia ordosica； Molecular docking technology； Flavonoids； Peroxisome proliferator-activated receptor-γ； Af- finity； Antidiabetic

過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）是配體激活轉(zhuǎn)錄因子核受體家族成員[1-2]，PPAR包括3種亞型：α、β/δ和γ。PPAR-γ系在脂肪組織、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、腸細(xì)胞、骨骼肌和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)最豐富的亞型，在調(diào)節(jié)胰島素敏感性、脂質(zhì)代謝、脂肪生成和葡萄糖的體內(nèi)平衡中具有重要作用，成為近十幾年來研究熱點(diǎn)[3]。

已知的PPAR-γ配體類型主要包括2種：生理性配體和藥理性配體。生理性配體包括內(nèi)源性的15-脫氧前列腺素J2及其代謝產(chǎn)物和飲食來源的不飽和脂肪酸等；藥理性配體有合成藥物噻唑烷二酮類（Thiazolidinedione，TZDs，PPAR-γ的高效配體）、L-酪氨酸衍生物（PPAR-α/γ雙重激動(dòng)藥）以及不斷發(fā)現(xiàn)的具有PPAR-γ激動(dòng)活性的天然產(chǎn)物和合成產(chǎn)物，其中以曾廣泛應(yīng)用于臨床的胰島素增敏劑TZDs最有名。分子對接是一種計(jì)算程序，可根據(jù)配體與受體作用的“鎖鑰原理”用于預(yù)測大分子的非共價(jià)結(jié)合情況。該技術(shù)的應(yīng)用使基于人體靶點(diǎn)的中藥天然產(chǎn)物活性成分的高效、快速篩選成為可能[4-5]。

黑沙蒿（Artemisia ordosica Krasch.）為菊科蒿屬植物，在前期研究中，筆者對黑沙蒿的資源分布、化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑沙蒿含有18種黃酮類化學(xué)成分[6]。本研究嘗試?yán)梅肿訉蛹夹g(shù)從黑沙蒿所含黃酮類化合物中篩選PPAR-γ激動(dòng)活性成分，并預(yù)測其與PPAR-γ的結(jié)合模式，旨在從分子水平探究黑沙蒿黃酮類化學(xué)成分通過PPAR-γ產(chǎn)生生理作用的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并進(jìn)一步為中藥化學(xué)成分的虛擬篩選提供參考和借鑒。

1 材料

PPAR-γ蛋白與羅格列酮的X-射線共結(jié)晶結(jié)構(gòu)文件來源于RCSB PDB Bank（Research Collaboratory for Structural Bioinformatics：Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do，PDB code：2PRG）；晶體結(jié)構(gòu)預(yù)處理采用分子建模軟件包Chimera 1.5.3（National Institutes of Health，USA）；受體加氫以及grid box（箱格）設(shè)置采用分子建模軟件包MGL Tools 1.5.4（The Scripps Research Institute，USA）處理；Chem3D Ultra 8.0軟件（Cambridge Soft Corporation，USA）；分子對接模擬應(yīng)用對接軟件AutoDock Vina 1.1.2（The Scripps Research Institute，USA）；軟件PyMOL v1.5（Schrodinger LLC，USA；用于分析和觀察配體-蛋白質(zhì)的對接構(gòu)象）。

2 方法

2.1 羅格列酮的藥效團(tuán)研究

從RCSB PDB Bank數(shù)據(jù)庫中下載PPAR-γ與其配體小分子藥物羅格列酮的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)（PDB code：2PRG）作為分子對接的受體模型。羅格列酮在本研究中作為陽性對照，因此基于共結(jié)晶結(jié)構(gòu)2PRG進(jìn)行了羅格列酮的藥效團(tuán)研究，重點(diǎn)對羅格列酮的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、PPAR-γ的關(guān)鍵螺旋、折疊、氨基酸殘基、重要水分子等進(jìn)行了總結(jié)。

2.2 基于PPAR-γ的分子對接研究

2.2.1 PPAR-γ的晶體結(jié)構(gòu)及預(yù)處理 X-射線衍射得到的靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)與生物體中實(shí)際情況往往略有差異，故需進(jìn)行預(yù)處理以接近其生理狀態(tài)。從2PRG 中分離出A鏈或B鏈，去除C鏈以及所有配體和水分子（關(guān)鍵水分子除外），并計(jì)算蛋白質(zhì)的質(zhì)子化態(tài)，備用。

2.2.2 配體構(gòu)建及預(yù)處理 黑沙蒿中已知的18種黃酮類化合物的平面結(jié)構(gòu)采用ChemDraw 軟件繪制，通過Chem3D Ultra 8.0軟件將二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)并使其能量最小化。對配體進(jìn)行預(yù)處理以使配體分子接近天然構(gòu)象，加載電荷，備用。

2.2.3 對接流程 綜合“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)，對接流程如下：（1）從RCSB PDB Bank數(shù)據(jù)庫中下載PPAR-γ與配體羅格列酮的共結(jié)晶晶體結(jié)構(gòu)（2PRG.pdb），去除C鏈，分離A鏈或B鏈，制備PPAR-γ monomer（.pdb格式文件）；去除所有配體和水分子（關(guān)鍵水分子除外），根據(jù)軟件默認(rèn)方法計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)子化態(tài)，受體加氫，設(shè)置grid box參數(shù)，使其覆蓋整個(gè)PPAR-γ monomer蛋白晶體以探尋所有可能的結(jié)合模式。（2）制備待對接配體，將二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)并使其能量最小化，加載電荷（.pdbqt格式文件）。（3）創(chuàng)建config.txt文件，將對接參數(shù)（grid box坐標(biāo)、exhaustiveness數(shù)值）輸入其中。（4）將PPAR-γ與黑沙蒿中所有已知黃酮類化合物進(jìn)行逐一對接（之前4步為預(yù)處理）。（5）根據(jù)配體的構(gòu)象、位置及對接親和力（軟件自動(dòng)給出）等對各種結(jié)合模式進(jìn)行綜合對比。

3 結(jié)果

3.1 已知PPAR-γ與配體羅格列酮的藥效團(tuán)研究

Nolte RT等于1998年報(bào)道了由人源PPAR-γ配體結(jié)合域（Ligand binding domain，LBD）、羅格列酮和類固醇受體共激活因子1（Human steroid receptor co-activating factor-1，SRC-1）組成的三元絡(luò)合物2PRG[7]。筆者對PPAR-γ的藥效團(tuán)進(jìn)行了總結(jié)，如圖1所示。

PPAR-γ LBD包含一個(gè)大的結(jié)合口袋，可容納不同配體進(jìn)入并形成適當(dāng)構(gòu)象從而組成配體-受體復(fù)合物。羅格列酮骨架被分為頭部（Head）、連接基（Linker）和尾部（Tail）。PPAR-γ激動(dòng)藥包含有一個(gè)親水性頭部Head，通過一個(gè)芳香連接基與疏水性尾部相連接。親水性頭部基團(tuán)通常含有羥基、羰基或羧基氧原子（例如，羧酸和2，4-噻唑烷二酮），可與PPAR-γ LBD的關(guān)鍵氨基酸殘基（Tyr473、His449、His323和Ser289）形成氫鍵（圖1中虛線）網(wǎng)絡(luò)。這些氫鍵有助于穩(wěn)定PPAR-γ于適當(dāng)?shù)臉?gòu)象，對共激活因子的成功攝取至關(guān)重要[8-9]。芳香中心與關(guān)鍵螺旋Helix 3的多個(gè)疏水性氨基酸殘基形成范德華力，而疏水性尾部則可允許多種取代基與PPAR-γ大的疏水性口袋以及自由水分子相互作用[10]。

3.2 基于PPAR-γ的分子對接研究

3.2.1 2PRG晶體結(jié)構(gòu)A鏈和B鏈的對比、選擇 2PRG晶體結(jié)構(gòu)包含了3個(gè)不對稱分子單元A、B和C（見圖2）。本研究去除了C鏈，對A鏈和B鏈進(jìn)行了分離及與羅格列酮的再對接試驗(yàn)。

A鏈和B鏈與配體羅格列酮的結(jié)合具有明顯的不同，A鏈缺失了與關(guān)鍵氨基酸殘基His449間的氫鍵結(jié)合（見圖3a）；B鏈缺失了與Glu286間的氫鍵結(jié)合（見圖3b）。此外，同一軟件（Chimera1.5.3）得到的位于PPAR- γ LBD尾部結(jié)合口袋的關(guān)鍵水分子（紅色球體）也不同。

分別以A鏈和B鏈為靶蛋白受體與羅格列酮進(jìn)行分子再對接試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)A鏈再對接結(jié)果呈現(xiàn)了所有關(guān)鍵的配體-受體氫鍵組合。對于B鏈，大部分的再對接構(gòu)象缺乏與氨基酸殘基His449和Glu286之間的氫鍵結(jié)合。同時(shí)，A鏈被認(rèn)為與激活態(tài)的PPAR-γ蛋白結(jié)構(gòu)相近[11]。因此，A鏈被選定用于PPAR-γ激動(dòng)活性成分的分子對接試驗(yàn)。

3.2.2 PPAR-γ LBD中水分子的選擇保留 PPAR-γ LBD尾部結(jié)合口袋未與羅格列酮形成氫鍵結(jié)合，且大的結(jié)合口袋允許諸多自由水分子的存在，并與羅格列酮存在范德華力等相互作用，尤其H2O604（注：604以及后文的308是水分子的標(biāo)號，此標(biāo)號為2PRG中固有標(biāo)號）（見圖 1中標(biāo)出的水分子）與羅格列酮分子吡啶環(huán)上的N原子形成了氫鍵結(jié)合，這對于羅格列酮在PPAR-γ LBD內(nèi)構(gòu)象的穩(wěn)定起著重要作用。鑒于此，本研究選擇了A鏈PPAR-γ LBD尾部結(jié)合口袋內(nèi)的若干重要水分子進(jìn)行考察，保留不同的水分子組合進(jìn)行再對接試驗(yàn)，最終選定H2O308、H2O339、H2O444和H2O467（A鏈水分子的標(biāo)識(shí)號在.mol2 格式的文件中的編號有所變化，與2PRG中編號有差異，但本研究中選擇的相應(yīng)水分子，隨后用PyMOL打開后發(fā)現(xiàn)其顯示了正常的編號）。此條件生成了與2PRG晶體接近、重現(xiàn)性高并排名第一的結(jié)合模式。

3.2.3 對接結(jié)果 將黑沙蒿藥材中已知的黃酮類化學(xué)成分與PPAR-γ 進(jìn)行分子對接，根據(jù)AutoDock Vina分子對接程序，每個(gè)化合物有9個(gè)分子對接模式，并按照所有模式的親和力進(jìn)行排名。與羅格列酮比較，所有化合物與PPAR-γ分子對接的親和力均略低于羅格列酮，從中篩選得到5 個(gè)親和力較高的化合物（親和力絕對值大于8.0，羅格列酮為-8.7 kcal/mol），其中以化合物3最高（-8.3 kcal/mol）。篩選結(jié)果（由對接軟件AutoDock Vina自動(dòng)給出，包括9個(gè)構(gòu)象中最高親和力、親和力平均值、9個(gè)構(gòu)象中位于PPAR-γ LBD內(nèi)的個(gè)數(shù)、最高親和力構(gòu)象與PPAR-γ形成的氫鍵結(jié)合情況）見表1。

3.2.4 PPAR-γ與配體的結(jié)合構(gòu)象 以得分較高的配體結(jié)合構(gòu)象用來預(yù)測PPAR-γ與激動(dòng)活性成分的結(jié)合模式，羅格列酮、化合物3與PPAR-γ受體的對接構(gòu)象如圖4所示。

羅格列酮與受體的氨基酸殘基Tyr473、His323、Gln286、Ser289形成4個(gè)氫鍵結(jié)合（虛線表示，見圖4a），得分最高的化合物3與受體的Tyr327、Arg288形成2個(gè)氫鍵結(jié)合（虛線表示，圖4b）。篩選出的其他化合物與化合物3相似，化合物中的A環(huán)與B環(huán)上的氧原子均易與PPAR-γ LBD活性位點(diǎn)形成1個(gè)（Tyr327）或2個(gè)（Tyr327、Arg288）氫鍵結(jié)合。分析可知，這些化合物均對接到PPAR-γ LBD活性位點(diǎn)，占據(jù)其結(jié)合腔，氫鍵結(jié)合將PPAR-γ的若干Helix固定，形成穩(wěn)定的構(gòu)象，對于PPAR-γ進(jìn)一步與靶基因結(jié)合以及PPAR-γ受體的激活起著重要作用[12]。所有化合物與羅格列酮的結(jié)合模式均不同（如形成氫鍵結(jié)合的氨基酸），提示對接親和力及激動(dòng)活性與羅格列酮有所不同。而對PPAR-γ受體的激動(dòng)活性尚需體內(nèi)外活性研究進(jìn)行驗(yàn)證。

4 討論

（1）分子對接用于預(yù)測小分子與蛋白的結(jié)合具有特殊的意義，可以用來進(jìn)行類藥分子的虛擬篩選，以獲得藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物，也可用于缺少實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的已知結(jié)合體的構(gòu)象的預(yù)測。迄今為止，采用分子對接技術(shù)對中藥化學(xué)成分進(jìn)行活性機(jī)制研究的報(bào)道不多。筆者以黑沙蒿為研究對象，拓展了分子對接技術(shù)在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和中藥作用機(jī)制研究方面的應(yīng)用。

（2）本文采用分子對接技術(shù)篩選黑沙蒿中PPAR-γ激動(dòng)活性成分，得到5種親和力較高的黃酮類化合物1～5。這些黃酮類化合物有望作為配體與PPAR-γ受體結(jié)合并使之激活，隨后與視黃醛X受體α形成異二聚體，結(jié)合到特異性DNA序列-PPAR特異性反應(yīng)元件而活化靶基因[13-15]。同時(shí)，這5種黃酮類化合物可能會(huì)成為PPAR-γ激動(dòng)藥的先導(dǎo)化合物，值得進(jìn)一步研究。

（3）配體最佳對接模式的選擇不僅需要考慮對接親和力，還應(yīng)結(jié)合對接模型的構(gòu)象觀察[16-18]。此外，分子對接模擬的應(yīng)用局限于前期研究，對化合物的進(jìn)一步活性測試依然是必要的。

（4）分子對接模擬是一種成本較低的虛擬篩選技術(shù)，對于活性結(jié)果的預(yù)測具有參考意義。分子對接過程中陽性對照化合物的選擇、目標(biāo)受體蛋白共晶的選擇、受體蛋白的處理、對接流程及條件的優(yōu)化（如本文中共晶結(jié)構(gòu)2PRG中A鏈、B鏈與羅格列酮的再對接、grid box參數(shù)的設(shè)置）對于預(yù)測待篩選分子的準(zhǔn)確活性至關(guān)重要。

綜上，采用分子對接技術(shù)篩選黑沙蒿中PPAR-γ激動(dòng)活性成分的方法可靠，黑沙蒿中5種黃酮類化合物與PPAR-γ的對接呈現(xiàn)了較高的親和力，但對接構(gòu)象與已知PPAR-γ激動(dòng)藥羅格列酮不同，黃酮類化合物A環(huán)與B環(huán)上的氧原子易與PPAR-γ受體的LBD活性位點(diǎn)形成1個(gè)（Tyr327）或2個(gè)（Tyr327、Arg288）氫鍵結(jié)合（羅格列酮與Tyr473、His343、Gln286和Ser289形成氫鍵結(jié)合），其中以化合物3（5，3′ ，4′ -三羥基-7-甲氧基黃酮）對接親和力最強(qiáng)。本研究為這5種黃酮類化合物與PPAR-γ靶點(diǎn)的結(jié)合以及用于治療2型糖尿病的化學(xué)成分研究提供了參考。

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（收稿日期：2017-04-24 修回日期：2017-06-13）

（編輯：劉 萍）