甘草提取物對雷公藤甲素損傷后人肝L—02細胞中UGT1A、MRP2表達的影響

張靖　胡騫　譚親友　朱勝楠

中圖分類號 R969.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）01-0065-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.17

摘 要 目的：考察甘草提取物（GE）對雷公藤甲素（TP）損傷后人肝L-02細胞中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A（UGT1A）、多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）表達的影響，研究甘草對TP的減毒機制。方法：采用MTT法測定0（空白對照）、40、80、160 nmol/L TP分別培養L-02細胞12、18、24 h后的細胞存活率。將L-02細胞分為空白對照組（空白培養基）、模型對照組（80 nmol/L TP）和GE預處理組（分別以30、60、90 mg/L GE預處理24 h后再加入80 nmol/L TP），繼續培養18 h后，采用MTT法檢測各組的細胞存活率。在上述分組（GE預處理組的GE濃度為60 mg/L）基礎上增設利福平（RIF）組（陽性對照，10 μmol/L RIF預處理24 h后再加入80 nmol/L TP），培養24 h后，檢測各組細胞中UGT1A、MRP2蛋白表達。結果：TP對細胞活性的抑制作用與濃度和時間呈正相關。與空白對照組比較，模型對照組的細胞存活率明顯降低（P<0.05），細胞中MRP2蛋白表達明顯減弱（P<0.01）。與模型對照組比較，30、60、90 mg/L GE預處理組的細胞存活率均明顯升高（P<0.01）；60 mg/L GE預處理組細胞中UGT1A和MRP2蛋白表達均明顯增強（P<0.01）。結論：GE預處理可減輕TP對人肝L-02細胞的損傷，其減毒機制可能與提高細胞中UGT1A、MRP2的表達有關。

關鍵詞 甘草提取物；雷公藤甲素；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A；多藥耐藥相關蛋白2；人肝L-02細胞

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of Glycyrrhiza uralensis extract （GE） on the expression of uridine diphosphate glucuronyltransferase 1A （UGT1A） and multidrug resistance associated protein 2 （MRP2） in human liver L-02 cells damaged by triptolide （TP）， and to study attenuated mechanism of G. uralensison for TP. METHODS： The survival rates of L-02 cells were determined by MTT assay after cultured with 0 （blank control）， 40， 80， 160 nmol/L TP for 12， 18， 24 h. L-02 cells were divided into blank control group （blank culture medium）， model control group （80 nmol/L TP） and GE pretreatment group （adding 80 nmol/L TP after pretreated with 30， 60， 90 mg/L GE for 24 h）； after cultured for 18 h， survival rates of L-02 cells were determined by MTT assay. Rifampin （RIF） group （positive control， adding 80 nmol/L TP after pretreated with 10 μmol/L RIF for 24 h） was added on the basis of the above grouping （GE concentration of 60 mg/L in GE pretreatment group）.After cultured for 24 h， the protein expressions of UGT1A and MRP2 were detected. RESULTS：The inhibition effect of TP on cell proliferation was positively correlated with the concentration and the time. Compared with blank control group， cell survival rate of model control group was decreased significantly （P<0.05）， and the protein expression of MRP2 was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model control group，cell survival rates of 30， 60， 90 mg/L GE pretreatment groups were all increased significantly （P<0.01）. The protein expressions of UGT1A and MRP2 were increased significantly in 60 mg/L GE pretreatment group （P<0.01）. CONCLUSIONS： GE pretreatment can relieve TP-induced human liver L-02 cell damage， and its attenuated mechanism may be associated with the increase the expression of UGT1A and MRP2.

KEYWORDS Glycyrrhiza uralensis extract； Triptolide； Uridine diphosphate glucuronyltransferase 1A； Multidrug resistance associated protein 2； Human liver L-02 cells

雷公藤甲素（Triptolide，TP）為環氧二萜內酯類化合物，是從雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）中分離的活性較強的有效成分之一[1]。TP在臨床主要用于治療類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、腎疾病及呼吸系統疾病等[2]，療效顯著。但同時TP也存在治療窗窄、水溶性差等缺點，對多種臟器都具有毒性，其中較為常見的是TP所致肝損傷[3]，這些毒副反應嚴重限制了其在臨床的推廣和應用。因此， 全面了解TP對肝的毒性作用機制，對研究開發TP的減毒增效方法，提高TP在臨床應用的安全性具有重要的實際意義。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）最早記載于《神農本草經》，其性味甘、平，歸心、肺、脾、胃經，有祛痰止咳、清熱解毒、調和諸藥等功效[4]。研究表明，甘草聯用其他藥物后，可能會改變藥物的代謝，從而影響藥物藥效，中和毒性[5]。

多藥耐藥相關蛋白2（MRP2/ABCC2）屬于ABC轉運蛋白超家族，主要分布于肝、腎及十二指腸，在體內主要介導結合物轉運入膽汁或尿，將體內有毒物質及相關代謝產物迅速排出體外，從而起到解毒的作用[6]。在生物體內，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A（Uridine diphosphate glucuronyltransferase 1A，UGT1A）是許多內、外源性物質進行相生物轉化時最重要的一種代謝酶。Ⅱ相反應中最重要的葡萄糖醛酸結合反應主要是在有關酶的催化下，使體內含有羥基或羧基的有毒物質經結合失活生成其非活性形式[7]，之后隨尿液排出體外，從而起到保肝解毒的作用。所以，本研究擬考察甘草提取物（GE）對TP損傷后人肝L-02細胞中UGT1A和MRP2表達的影響，為闡明GE對TP肝毒性的保護作用及可能的減毒機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

model 680酶標儀、Mini Protean Tetra小型垂直電泳儀、Gel Doc 2000凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；IX73倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；5424R臺式冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）

1.2 藥品與試劑

GE（西安瑞鴻生物技術有限公司，批號：20150901，甘草酸鈉鹽含量：11.8%）；利福平（Rifampicin，RIF）原料藥、TP（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：D1601041、G1227035，純度：≥97%、≥98%）；兔UGT1A、MRP2多克隆抗體（美國Abcam 公司）；鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（中杉金橋生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）、HRP標記山羊抗兔IgG二抗（美國Proteintech Group公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：123115160511）；RPMI- 1640培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（山西潤生血清生物材料有限公司）； MTT、青鏈霉素混合液（100×）雙抗及0.25%胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 細胞

正常人肝L-02細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所，由桂林醫學院科學實驗中心傳代凍存。

2 方法

2.1 溶液的制備

GE、TP和RIF均用二甲基亞砜（DMSO）充分溶解（DMSO體積比均小于1%），然后用RPMI-1640培養基稀釋以上溶液為工作液，得GE終質量濃度分別為30、60、90 mg/L（根據本課題組前期研究及文獻[8-9]設置，均以提取物量計）；RIF終濃度為10 μmol/L；TP終濃度分別為40、80和160 nmol/L。將制備好的各工作液用0.22 μm過濾器過濾除菌，保存于4 ℃冰箱中，備用。

2.2 細胞培養

將人肝L-02細胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養基中（約4～5 mL），然后將培養瓶置于37 ℃、5%CO2培養箱內進行常規培養，每1～2天換液1次。每天觀察細胞生長情況，當細胞長至80%～90%融合時，按1 ∶ 4的比例傳代或凍存，選取對數生長期的細胞用于后續試驗。

2.3 MTT試驗檢測TP對L-02細胞的毒性及GE的保護作用

2.3.1 TP對L-02細胞的毒性作用 取細胞混懸液100 μL，接種于96孔培養板中（5 000個/孔），培養24 h細胞貼壁后，將細胞分為空白對照組（僅加入空白培養基）和40、80、160 nmol/L TP組，每組6個復孔，將各組細胞分別培養12、18、24 h后，采用倒置顯微鏡觀察細胞形態并拍照，然后在培養板孔中分別加入MTT（5 mg/mL）溶液20 μL，置于37 ℃培養箱中繼續孵育4 h；4 h后終止培養，吸盡上清，加DMSO（150 μL/孔）；最后在酶標儀上490 nm波長處測定各孔吸光度（A），并計算細胞存活率（%）：（A加藥組/A空白對照組）×100%，從而選擇出誘導肝細胞損傷的最佳TP濃度及作用時間。

2.3.2 GE預處理對TP所致L-02細胞損傷的保護作用 按“2.3.1”項下方法設置空白對照組、模型對照組（這兩組僅加入空白培養基）和30、60、90 mg/L GE預處理組，每組設6個復孔。將細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h，吸盡每孔液體，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍。接著，空白對照組細胞繼續加入空白培養基，模型對照組和給藥組分別加入80 nmol/L的TP，置于37 ℃、5%CO2培養箱內繼續培養18 h。結束培養后按照“2.3.1”項下方法進行MTT檢測，并計算細胞存活率。

2.4 Western blot法檢測細胞中UGT1A和MRP2蛋白表達

取細胞懸液100 μL，接種于6孔板中（2×105個/孔），培養24 h貼壁后，將細胞分為空白對照組、模型對照組（這兩組僅加入空白培養基）、RIF組（加入10 μmol/L的RIF）和GE預處理組（加入GE 60 mg/L）。將細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱內繼續培養24 h后，吸盡孔中液體，PBS沖洗3遍；除空白對照組細胞加入培養基外，其余各組細胞均加入80 nmol/L的TP，置于37 ℃、5%CO2培養箱內繼續培養18 h。收集細胞于EP管中，加入蛋白裂解液裂解，渦旋振蕩，低溫離心，收集上清液（即細胞總蛋白）。采用BCA 蛋白定量試劑盒測得蛋白濃度并進行電泳操作，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入兔UGT1A（1 ∶ 2 000）、MRP2（1 ∶ 500）一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3遍后，分別加入相應二抗（1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜3遍后，化學發光法發光顯影。采用Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達水平。

2.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析。數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 MTT試驗結果

3.1.1 TP對L-02細胞的毒性作用測定結果 細胞形態學觀察結果顯示，空白對照細胞貼壁生長，多呈梭形且透亮，易融合成片且邊界清晰。TP作用后，細胞密度減小、細胞形態發生改變、脫壁細胞數增多。160 nmol/L的TP作用12 h后的細胞密度較80 nmol/L的TP作用18 h略大，但損傷程度無明顯變化；而80 nmol/L的TP作用24 h及160 nmol/L的TP作用18、24 h后細胞密度明顯減小，細胞損傷過度。結合細胞存活率測定結果，除40 nmol/L的TP作用12 h后細胞存活率降低不顯著外，其余各組細胞存活率較空白對照組均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。但在選擇最佳誘導細胞損傷的TP濃度時，細胞存活率應不低于60%，若細胞存活率過低，提示TP對細胞造成過度損傷，過度損傷的細胞再用保肝藥物進行干預，效果不明顯。故本研究最終選擇80 nmol/L的TP作用18 h進行細胞損傷。細胞形態觀察結果見圖1，細胞存活率測定結果見表1。

3.1.2 GE對TP所致L-02細胞損傷的保護作用測定結果 與空白對照組比較，模型對照組細胞存活率顯著降低（P<0.01）；與模型對照組比較，不同質量濃度GE預處理組細胞存活率均顯著升高（P<0.01），且具有一定的濃度依賴性，結果見表2。

3.2 Western blot試驗結果

與空白對照組比較，其余各組細胞中MRP2蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），GE預處理組和RIF組細胞中UGT1A蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型對照組比較，GE預處理組和RIF組細胞中UGT1A、MRP2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。電泳圖見圖2，測定結果見表3。

4 討論

中藥單體TP在臨床上應用廣泛，但長期用藥毒性易蓄積，對消化系統、生殖系統及血液系統等都有毒性作用[10]，其中以TP所致急性肝損傷較為突出。以往研究表明，TP可誘導肝細胞凋亡，抑制細胞中谷胱甘肽和抗氧化酶活性，使得細胞中活性氧簇（ROS）相應地增多，從而導致肝細胞變性壞死、膜通透性增強，血清中轉氨酶含量升高[11-12]。中藥方劑中多配伍甘草以緩其性。研究表明[13]，甘草酸二銨可誘導細胞色素P4503A4（CYP3A4）上調和降低ROS水平，對減輕TP誘導的正常肝細胞毒性起到重要作用。也有研究表明，甘草乙醇提取物通過調控核因子相關因子2（Nrf2）/抗氧化反應元件（ARE）信號通路，減輕TP誘導的氧化應激[9]。同時Ⅱ相解毒酶——葡萄糖醛酸轉移酶（UGTs）、谷胱甘肽S轉移酶（GSTs）與轉運體G蛋白耦聯受體（MRPs）在去除毒代謝物和排泄等方面起著重要的作用，并且協同作用密切，其有可能同時受到Nrf2/ARE 信號轉導通路的調控，加強毒物的外排。因此，考察GE對TP誘導的肝細胞毒性及對相關蛋白的影響具有實際意義。RIF臨床主要用于各種結核病的治療，同時其是一個具有選擇性和多向性的藥物代謝酶誘導劑，具有誘導肝多種代謝酶的作用，能加速肝藥酶的合成并增強其活性[14]，故在本研究中以其為陽性對照藥。

本研究通過采用MTT法檢測細胞存活率來研究GE對TP所致L-02細胞損傷的影響。研究結果顯示，在培養時間為18 h的情況下，TP可顯著降低細胞存活率（P<0.01），并且TP的作用具有一定的時間和濃度依賴性，此結果與兩項研究[15-16]報道的結果一致。TP致肝細胞損傷18 h后，GE預處理24 h可顯著提高細胞存活率，這說明GE可降低TP引起的肝毒性。本研究采用Western blot法通過體外細胞試驗，探討了GE對TP損傷后L-02細胞中UGT1A和MRP2的影響。結果顯示，雖TP組細胞中UGT1A蛋白表達水平較空白對照組略有增加，但差異并無統計學意義（P>0.05）。此結果與課題組前期研究結果略有差異，考慮差異的引起與細胞接種的密度可能有一定關系，但還需后期進行進一步驗證和探索。GE預處理組細胞中UGT1A和MRP2表達水平升高，可加速有毒物質從體內代謝和消除，減少膽汁中有害成分的蓄積，從而降低TP引起的肝毒性。

綜上所述，GE預處理可減輕TP對人肝L-02細胞的損傷，其減毒機制可能與誘導細胞中UGT1A和MRP2蛋白的表達有關，但確切的作用機制有待進一步證實。

參考文獻

[ 1 ] KONG LL， ZHUANG XM， YANG HY， et al. Inhibition of P-glycoprotein gene expression and function enhances triptolide-induced hepatotoxicity in mice[J]. Sci Rep，2015.DOI：10.1038/srep11747.

[ 2 ] WANG X， SUN L， ZHANG L， et al. Effect of adoptive transfer or depletion of regulatory T cells on triptolide-induced liver injury[J]. Front Pharmacol，2016.DOI：10.3389/ fphar.2016.00099.

[ 3 ] LI J， SHEN F， GUAN C， et al. Activation of Nrf2 prote- cts against triptolide-induced hepatotoxicity[J]. PLoS One，2014，9（7）：e100685.

[ 4 ] 高曉娟，趙丹，趙建軍，等.甘草的本草考證[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（2）：193-198.

[ 5 ] JI S， LI Z， SONG W， et al. Bioactive constituents of gly- cyrrhiza uralensis （licorice）： discovery of the effective components of a traditional herbal medicine[J]. J Nat Prod，2017，79（2）：281-292.

[ 6 ] EDAVANA VK，PENNEY RB，YAOBORENGASSER A， et al. Effect of MRP2 and MRP3 polymorphisms on anastrozole glucuronidation and MRP2 and MRP3 Gene expression in normal liver samples[J]. Int J Cancer Res Mol Mech，2015，1（3）：26-39.

[ 7 ] FUJIWARA R， YOKOI T， NAKAJIMA M. Structure and proteinprotein interactions of human UDP-glucuronosyltransferases[J]. Front Pharmacol，2016.DOI： 10.3389/fphar.2016. 00388.

[ 8 ] CAO LJ， LI HD， YAN M， et al. The protective effects of isoliquiritigenin and glycyrrhetinic acid against triptolide-induced oxidative stress in HepG2 cells involve Nrf2 activation[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2016.DOI：10.1155/2016/8912184.

[ 9 ] CAO LJ， HOU ZY， LI HD， et al. The ethanol extract of licorice （glycyrrhiza uralensis） protects against triptolide-induced oxidative stress through activation of Nrf2[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2017.DOI：10.1155/2017/2752389.

[10] ZIAEI S， HALABY R. Immunosuppressive， anti-inflammatory and anti-cancer properties of triptolide： a mini review[J]. Avicenna J Phytomed，2016，6（2）：149-164.

[11] LI XJ， JIANG ZZ， ZHANG LY. Triptolide： progress on research in pharmacodynamics and toxicology[J]. J Ethnopharmacol，2014，155（1）：67-79.

[12] ZHANG H， YA G， RUI H. Inhibitory effects of triptolide on human liver cytochrome P450 enzymes and P-glycoprotein[J]. Eur J Drug Pharmacokinet，2016，42（1）：1-10.

[13] TAI T， HUANG X， SU Y， et al. Glycyrrhizin accelerates the metabolism of triptolide through induction of CYP3A in rats[J]. J Ethnopharmacol，2014，152（2）：358-363.

[14] BANEYX G， PARROTT N， MEILLE C， et al. Physiologically based pharmacokinetic modeling of CYP3A4 induction by rifampicin in human： influence of time between substrate and inducer administration[J]. Eur J Pha- rm Sci，2014，56（1）：1-15.

[15] LIU X， LIU Y， CHENG M， et al. Metabolomic responses of human hepatocytes to emodin， aristolochic acid， and triptolide： chemicals purified from traditional Chinese me- dicines[J]. J Biochem Mol Toxicol，2015，29（11）：533-543.

[16] 姚金成，劉穎，胡領，等.雷公藤甲素誘導肝細胞L-02凋亡的作用機制研究[J].中國藥房，2013，24（11）：964-967.

（收稿日期：2017-03-13 修回日期：2017-11-07）

（編輯：林 靜）