制川烏凝膠膏劑基質處方優化及體外釋放研究

吳璐　吳維剛　江亭　王希霖　楊華生

中圖分類號 R283 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）01-0037-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.10

摘 要 目的： 優化制川烏凝膠膏劑基質處方工藝并考察其體外釋放特性。方法：以初黏力、剝離強度、感官評價的綜合評分為評價指標，采用星點設計-響應面法優化制川烏凝膠膏劑基質中聚丙烯酸鈉（NP700）、甘羥鋁、酒石酸、聚乙烯吡咯烷酮K90（PVP K90）的比例。采用改良的Franz擴散池法，以制川烏中6種酯型生物堿[苯甲酰新烏頭原堿（BM）、苯甲酰烏頭原堿（BA）、苯甲酰次烏頭原堿（BH）、新烏頭堿（MT）、次烏頭堿（HT）、烏頭堿（AT）]的累積釋放量為評價指標，進行制川烏凝膠貼膏劑的體外釋放試驗。結果：優化的基質處方為NP700-甘羥鋁-酒石酸-PVP K90（1.72 ∶ 0.10 ∶ 0.02 ∶ 1.65，m/m/m/m）；驗證試驗中BM、BA、BH、MT、HT、AT 6種酯型生物堿的含量分別為52.77、28.52、28.78、8.81、8.75、8.21 μg/g，綜合評分為118.67±1.33（RSD=4.62%，n=3）。BM的體外釋放行為符合Higuchi方程，其余5種生物堿體外釋放行為符合零級動力學方程，BM、BA、BH、MT、HT、AT 12 h累積釋放量分別為12.04、2.95、3.55、2.64、2.48、1.97 μg/cm2。結論：優化基質處方所制備的制川烏凝膠膏劑外觀、黏著力及體外釋放效果良好。本研究可為制川烏的新劑型開發提供依據。

關鍵詞 制川烏；凝膠膏劑；基質處方優化；星點設計；體外釋放；酯型生物堿

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize formulation matrix of processed Aconitum carmichaelii hydrogel patch， and to investigate its in vitro drug release. METHODS： The ratio of NP700， dihydroxyaluminum aminoacetate， tartaric acid and PVP K90 in processed A. carmichaelii hydrogel patch matrix was optimized by central composite design-response surface method （CCD-RSM） with initial adhesion， peel strength and sensory evaluation as evaluation indexes. The modified Franz diffusion cell method was used for in vitro drug release test processed A. carmichaelii hydrogel patch using accumulative release amount of six ester type alkaloids benzene [benzoyl mesaconine （BM）， benzoyl aconitum （BA）， benzoylhy paconine （BH）， mesaconitine （MT）， hypaconitine （HT） and aconitine （AT）] as evaluation indexes. RESULTS： The optimal matrix formulation was NP700-dihydroxyaluminum aminoacetate-tartaric acid- PVP K90 （1.72 ∶ 0.10 ∶ 0.02 ∶ 1.65， m/m/m/m）. In validation test， the contents of six ester type alkaloids were 52.77， 28.52， 28.78， 8.81， 8.75， 8.21 μg/g（RSD<5%，n=3）， comprehensive score was 118.67±1.33 （RSD=4.62%， n=3）. The release behavior of BM in vitro conformed to the Higuchi equation. The release behaviors of other 5 alkaloids were consistent with the Higuchi equation. 12 h accumulative release amounts of BM， BA， BH， MT， HT and AT were 12.04， 2.95， 3.55， 2.64， 2.48， 1.97 μg/cm2， respectively. CONCLUSIONS： The processed A. carmichaelii hydrogel patch prepared by matrix prescription is good in appearance， adhesion and in vitro release. The research can provide a basis for the development of new dosage form of processed A. carmichaelii.

KEYWORDS Processed Aconitum carmichaelii； Hydrogel patch； Matrix formulation optimization； Central composite design； In vitro drug release； Ester type alkaloids

制川烏為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmchaeli Dex.的干燥母根炮制品。現代研究表明，制川烏中含有毒性較強的雙酯型生物堿烏頭堿（Aconitine，AT）、次烏頭堿（Hypaconitine，HT）、新烏頭堿（Meaconitine，MT）及毒性較低的單酯型生物堿苯甲酰烏頭原堿（Benzoylaconine，BA）、苯甲酰次烏頭原堿（Benzoylhypaconine，BH）、苯甲酰新烏頭原堿（Benzoylmesaconine，BM），以及毒性更低的脂型生物堿。AT、HT、MT為制川烏中藥理活性成分，同時亦是毒性成分，常引起神經和心臟毒性。由于口服毒性較大[1-3]，制川烏在外用制劑中，尤其是在傳統橡皮膏與黑膏藥中應用更為廣泛，主要用于治療風濕痹癥[4]。傳統橡皮膏、黑膏藥劑型與現代凝膠膏劑比較，在載藥量、皮膚刺激性方面有一些缺陷。凝膠膏劑的基質主要為親水性高分子材料，對中藥提取物的親和性更好[5]。本試驗將制川烏生物堿提取物制備成凝膠膏劑，采用星點設計-響應面法對凝膠膏劑基質處方進行優化，并對優化處方基質制備的凝膏的體外釋放行為進行了研究，為制川烏外用新劑型開發提供基礎。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，包含Agilent化學工作站（美國Agilent公司）；YB-P6智能透皮試驗儀（天津藥典標準儀器廠）；BS110S電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.2 對照品與試劑

BM（批號：111795-201102）、BA（批號：111794- 201102）、BH（批號：111796-201002）、MT（批號：110799- 201106）、HT（批號：110798-201307）、AT（批號：101720- 201111）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度：均大于98%；聚丙烯酸鈉（NP700，陜西太白山制藥有限責任公司）；甘羥鋁（陜西太白山制藥有限責任公司）；丙三醇（國藥集團化學試劑有限公司）；酒石酸（西隴化工股份有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮K90（PVP K90，天津市博迪化工有限公司）；水為自制純化水，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

制川烏飲片購自江油恒源藥業集團有限公司，產地四川，經江西中醫藥大學付小梅教授鑒定為毛茛科植物烏頭母根的炮制加工品[6]；制川烏生物堿提取液為自制液[7-8]，含BM、BA、BH、MT、HT、AT分別為593.56、320.8、323.69、110.39、98.44、92.32 μg/mL。

2 方法與結果

2.1 凝膠膏劑的制備

A相制備：分別稱取處方量的PVP K90、酒石酸以及制川烏提取液，混合均勻后加入剩余量的水，即得。

B相制備：分別稱取處方量的甘油、NP700、甘羥鋁，將NP700和甘羥鋁均勻分散于甘油中，即得。

將A相一次性加入B相中，快速研磨，待混合均勻后將其涂于帶背襯層的無紡布上，室溫放置24 h，即得。

2.2 凝膠膏劑質量評價方法的建立

2.2.1 感官評分 參考文獻[9-10]的方法，以膏體外觀的均勻性、稠度、涂展性、皮膚追隨性和反復揭貼與殘留性為主觀考察指標，每個指標20分。

2.2.2 初黏力評分 參考2015年版《中國藥典》（四部）通則0952黏附力測定第一法測定[11]。記錄供試品能黏住的最大球號。評分標準為：14號小球計60分；13號小球計48分；12號小球計36分；11號小球計24分；10號小球計12分；9號及以下小球計0分。

2.2.3 剝離強度評分 參考2015年版《中國藥典》（四部）通則0952黏附力測定第三法測定[11]。記算剝離強度。評分標準為：3.3～3.8 N計20分；2.8～3.3 N計16分；2.3～2.8 N計12分；1.8～2.3 N計8分；1.3～1.8 N計4分；1.3 N以下計0分。

2.2.4 評分指標 在單因素試驗中以感官評價和初黏力為評價指標，在星點設計-效應面法優化試驗中以基質的感官評價、初黏力和剝離強度的綜合評分為評價指標，綜合評分=感官評分+剝離強度評分+初黏力評分[12-13]。

2.3 單因素試驗

按照“2.1”項下方法制備凝膠膏劑，以感官評價和初黏力為評價指標，對凝膠膏劑性能影響較大的NP700、甘羥鋁、甘油、酒石酸、PVP K90用量5個因素選取合適的水平進行考察，固定其他成分含量不變，加水至100 g。結果，按綜合評分≥60分確定各組分的用量范圍分別是： NP700 0.65～2.65 g、甘羥鋁0.05～0.17 g、甘油6～10 g、酒石酸0.015～0.110 g、PVP K90 0.6～1.8 g。單因素試驗設計與結果見表1。

2.4 星點設計-響應面法優化基質處方

2.4.1 試驗設計 單因素考察甘油加入量為6 g時，凝膠膏劑成型性好，因此，固定甘油的加入量為6 g。在此基礎上，以綜合評分為指標，考察NP700（X1）、甘羥鋁（X2）、酒石酸（X3）、PVP K90（X4）的最優用量。按“2.1” 項下方法制備凝膠膏基質，按“2.2”項下方法計算各指標得分。因素與水平見表2。星點設計與結果見表3。

2.4.2 線性擬合與方差分析 采用Design-Expert 8.06軟件進行多元回歸擬合，得到的基質綜合評分（Y）與基質因素變量的二次回歸方程模型為Y=3.67+58.92X1+71.39X2+736.87X3+56.03X4-16.67X1X2-100X1X3+8.33X1X4-1 666.67X2X3+222.22X2X4-100X3X4-17.4X12-1 361.11X22-2960X32-30.28X42。方差分析結果說明該模型顯著（P<0.000 1，R2=0.910 9），預測好（失擬項P=0.257 5>0.05），試驗穩定性好（變異系數CV=5.78%），詳見表4。

2.4.3 響應面法優化試驗 根據“2.4.2”項下結果，選擇對模型有顯著作用的X1、X3、X4及交互作用顯著的X1X4、X2X3、X2X4、X3X4繪制響應面的三維圖和等高線圖，詳見圖1。

由圖1A可知，NP700與PVP K90、NP700和甘羥鋁、NP700和酒石酸的三維圖曲面陡峭，且等高線圖呈橢圓形，說明各因素之間存在交互作用。

2.4.4 驗證試驗 利用Design-Expert 8.06軟件優化處方為NP700 1.72 g、甘羥鋁0.10 g、PVP K90 1.65 g、酒石酸0.02 g。其預測最大綜合評分為118.78。按照最優處方條件制備3批樣品進行驗證，樣品中制川烏6種酯型生物堿BM、BA、BH、MT、HT、AT的含量分別為52.77、28.52、28.78、8.81、8.75、8.21 μg/g，結果顯示綜合評分為118.67±1.33（RSD=4.62%，n=3），與預測值的相對誤差為0.09%，提取模型預測較好，結果見表5。

2.5 制川烏6種酯型生物堿含量測定方法建立及體外釋放試驗

參考文獻[8，14]的方法。

2.5.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：四氫呋喃300 mL+乙腈500 mL，流動相B：醋酸銨0.77 g+純化水1 000 mL+冰醋酸0.5 mL，梯度洗脫（0～48 min，15%A；48～49 min，26%→35%A；49～58 min，35%A；58～65 min，35%→15%A）；流速：1 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：40 μL。

2.5.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取AT、HT、MT、BA、BH和BM對照品適量，用0.01 mol/L鹽酸水溶液制成質量濃度分別為54.4、151.2、134.4、50.8、49.2、331.2 μg/mL的混合液對照品溶液，即得。

2.5.3 樣品溶液的制備 取表3中各膏劑，加氨試劑調節pH 10左右，用氯仿萃取5次，每次10 mL，合并氯仿，低溫蒸干，殘渣用2 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液溶解，過濾后按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定。

2.5.4 空白對照溶液的制備 取空白接收液15 mL，加氨試劑調節pH 10左右，用氯仿萃取5次，每次10 mL，合并氯仿，低溫蒸干，殘渣用0.01 mol/L鹽酸溶液2 mL溶解，過濾后按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定。

2.5.5 方法學考察 按“2.5.1”項下色譜條件，對接收液中BM、BA、BH、MT、HT和AT等6種生物堿含量測定方法學進行考察，結果6種生物堿線性關系良好，進樣量線性范圍分別為8.28～165.60、6.35～127.00、12.30～123.00、6.72～134.40、7.56～151.20、8.16～81.60 ng/mL，精密度試驗中RSD均小于2%（n=6），重復性試驗中RSD值均小于3%（n=3），16 h內穩定性試驗中RSD值均小于2%（n=6），空白樣品對6中生物堿含量測定無干擾，分離度均大于1.5，色譜圖見圖2。

2.5.6 體外釋放試驗 按優化后處方制備制川烏凝膠貼膏，用0.8 μm微孔濾膜替代皮膚，將凝膠貼膏貼于微孔濾膜上，采用改良Franz擴散池法進行試驗。擴散池的有效面積為1.76 cm2，15 mL生理鹽水作為接收液，溫度控制在（37±0.2）℃，磁攪拌轉速為300 r/min。于0.5、1、4、6、8、12 h取出全部接收液，同時補充空白接收液。按“2.5.3”項下方法制備樣品，按“2.5.1”項下條件測定峰面積并計算累積釋放量（Q）[15]。

2.5.7 數據處理與分析 單位面積下Q的計算公式為Qn=（ΣCi·V）/A，以Qn對t 做曲線，并對曲線進行擬合。式中Ci是第i個取樣點測得的藥物質量濃度。本試驗中，i=0.5、1、4、6、8、12；V為15 mL；A為1.76 cm2。繪制Q-t曲線，結果見圖3。

凝膠膏劑中BM、BA、BH、MT、HT、AT的12 h Q值分別為12.04、2.95、3.55、2.64、2.48和1.97 μg/cm2（n=6）。對上述釋放數據進行擬合，結果見表6。

由表6可知，BM的體外釋放規律符合Higuchi方程，提示其釋放的主要形式是擴散，且具有緩釋效應。BA、BH、MT、HT、AT的體外釋放規律符合零級動力學方程，提示藥物基本上是恒速緩慢釋放，釋放過程與藥物濃度無關。

3 討論

本試驗在用單因素試驗篩選基質處方用量時發現，NP700、甘羥鋁、甘油、酒石酸、PVP K90等輔料的用量對凝膠膏劑性能的影響并不是單純的線性關系，輔料的用量存在一定的最佳范圍。另外，輔料之間可能也存在一些交互作用，比如甘羥鋁與酒石酸的用量對NP700交聯的影響，可能是影響凝膠膏基質性能的關鍵。綜合以上因素，筆者采用星點設計-響應面優化法進行凝膠基質最優處方的篩選，該方法能對影響因素進行非線性擬合，并能同時考慮多個因素對試驗結果的影響，通過響應面圖反映結果較為直觀，且對結果預測較好，比較適合用于凝膠膏劑處方的優化。

通過體外釋放試驗發現，制川烏凝膠膏劑中BM的主要釋藥方式為自由擴散，而其他5種生物堿為緩慢恒速釋放；此外，3種單酯型生物堿在用藥后1 h內具有一定突釋效應，3種雙酯型生物堿的釋放具有時滯性。6種成分釋放行為的差異可能與其含量和化學結構有關。BM含量遠高于其他5種生物堿，從含量較高的凝膠骨架中以擴散的方式緩慢釋放到含量較低的接受液中；其他5種生物堿由于含量低，無法自由擴散，凝膠骨架對其釋放產生了控釋作用。單酯型生物堿水溶性較強，比較容易釋放到接收液中，因此有突釋效應；雙酯型生物堿親脂性較強，較難從凝膠骨架中釋放到接收液中，因此產生了時滯效應。

凝膠膏劑屬于經皮給藥制劑，2015年版《中國藥典》（四部）對經皮給藥制劑的藥物釋放沒有明確規定。目前，多采用Franz擴散池法研究經皮給藥制劑中藥物的體外透皮行為。本試驗在參考文獻基礎上，用0.8 μm的微孔濾膜代替皮膚，研究制川烏凝膠膏中6種生物堿的體外釋放行為，可初步反映制川烏凝膠膏劑體外釋放的特征，為經皮給藥制劑的體外釋放研究與質量評價方法提供參考。課題組將進一步研究制川烏凝膠膏劑的體外透皮釋藥特征與局部藥動學特征，并進行體內外相關性研究。

綜上，本試驗制備的制川烏凝膠膏劑基質載藥量高，外觀、黏著力及體外釋放效果良好；本研究為制川烏的新劑型開發提供了基礎，并為制川烏凝膠膏劑的應用提供了依據。

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（收稿日期：2017-03-23 修回日期：2017-11-15）

（編輯：劉明偉）