基于分子對接技術的金蓮花主要成分抗病毒和抗炎機制預測

方明月 李德利 劉雙月 王青青 賡迪 馬超 王如峰

摘要：目的 利用分子對接技術預測金蓮花中牡荊素、葒草素、牡荊素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2"-O- β-L-半乳糖苷、藜蘆酸、金蓮花堿的抗病毒和抗炎機制。方法 運用Discovery Studio 2.5軟件和藥物化學數據庫，將金蓮花的6個活性成分與Toll樣受體蛋白（TLRs）及神經氨酸酶（NA）靶點進行分子對接，通過模擬運算，分析對接結果及其功能區域的相互作用關系。結果 牡荊素、葒草素、牡荊素-2"-O-β-L-半乳糖苷、藜蘆酸、金蓮花堿均作用于1種或多種TLR，而葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷與3種TLR均無相互作用；黃酮類化合物，即牡荊素、葒草素、牡荊素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷均可與NA結合，而藜蘆酸和金蓮花堿與NA無相互作用。結論 金蓮花的6個活性成分中，5個成分可影響TLRs介導的信號通路，TLR3、4、7是其抗病毒抗炎作用的潛在靶點；4個黃酮類化合物可通過作用于NA而影響流感病毒活性。本研究可為探討金蓮花的抗病毒和抗炎有效成分及其進一步開發利用提供依據。

關鍵詞：金蓮花；分子對接；Toll樣受體蛋白；神經氨酸酶；抗病毒；抗炎

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.014

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0057-05

Abstract： Objective To predict the antiviral and anti-inflammatory mechanisms of major compounds from the flowers of Trollius chinensis， namely， vitexin， orientin， 2”-O-β-L-galactopyranosylvitexin， 2”-O-β-L-galactopyranosylorientin， veratric acid， and trolline， by using the molecular docking technique. Methods Discovery Studio 2.5 software and Chinese Medicine Chemistry Database were employed for docking between the ligands including 6 compounds and the proteins including Toll-like receptors （TLRs） and neuraminidase （NA）. The docking results and interactions of their functional domains were obtained by simulation analysis. Results Vitexin， orientin， 2”-O-β-L-galactopyranosylvitexin， veratric acid， and trolline were applied to one or more TLR， whereas 2”-O-β-L-galactopyranosylorientin could interact with neither of the proteins investigated. Flavonoids， namely vitexin， orientin， 2”-O-β-L-galactopyranosylvitexin and 2”-O-β-L-galactopyranosylorientin were applied to NA， whereas veratric acid and trolline could not interact with NA. Conclusion Five out of the 6 compounds have influence on the signaling pathways mediated by TLRs， and TLR3， 4， and 7 are their potential targets for antivirus and anti-inflammation. Four flavonoids can affect the activity of influenza virus by interacting with NA. This study can provide a basis for the investigation of the antiviral and anti-inflammatory effective compounds of the flowers of Trollius chinensis and the further development.

Keywords： Trollius chinensis； molecular docking； Toll-like receptors； neuraminidase； antiviral； anti-inflammatory

金蓮花為毛茛科植物金蓮花Trollius chinensis Bge.的干燥花[1]，功效清熱解毒、利咽消腫，臨床用于治療上呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎、急性中耳炎等疾病[2]。金蓮花中黃酮類成分含量最高，約占干重的16%，牡荊素、葒草素，牡荊素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷為其重要的黃酮類成分。酚酸類化合物的含量在金蓮花中居第2位，包括藜蘆酸、金蓮花苷、原金蓮酸等，而生物堿類是其中含量較少的一類成分，目前主要發現了金蓮花堿[3-5]。藥理研究表明，金蓮花及其主要成分具有抗病毒、抗炎、抗菌等生物活性，但其抗病毒和抗炎機制尚不明確[6-8]。

Toll樣受體蛋白（TLRs）通過胞外區感應組織中的危險信號，經相應的接頭蛋白進行信號傳導，激活相關的核內基因，從而誘導感染性炎癥和非感染性炎癥的產生[9-10]。神經氨酸酶（NA）是一種流感病毒糖蛋白，能催化水解唾液酸末端的N-乙酰基神經氨酸與鄰近寡糖D-半乳糖或D-氨基半乳糖之間的α（2，6）或α（2，3）糖苷鍵，使成熟的病毒顆粒最終脫離宿主細胞，感染新的上皮細胞，造成流感病毒在患者體內的擴散[11]。

近年來，計算機輔助藥物設計方法得到迅速發展，為合理設計新藥物提供了一定的理論指導。分子對接技術是計算機輔助藥物設計的重要組成部分，已成為作用機制預測和活性虛擬篩選的新興工具[12-15]。通過計算機模擬藥物分子產生藥效反應的過程，發現與藥物分子相互結合、產生相互作用的靶蛋白。通過分子對接技術，可確定復合物中靶點與配體正確的相對位置和取向，了解兩者的相互作用，預測藥物作用機制并提供新藥設計的基礎[16-17]。本研究利用分子對接技術，對金蓮花中6種主要成分進行抗病毒和抗炎機制預測。

1 材料

Discovery Studio 2.5軟件為網絡免費授權軟件，運行于Localhost（Windows32）操作系統。TLR3、TLR4、TLR7、NA的結構信息來源于蛋白數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）。化合物的三維結構信息來源于PubMed數據庫（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）。

2 方法與結果

2.1 結構預處理

在蛋白數據庫中搜索并下載TLR3、TLR4、TLR7、NA蛋白晶體結構文件。TLR3為人源，其蛋白編號為1ZIW；TLR4為鼠源，其蛋白編號為5IJB；TLR7為猴源，其蛋白編號為5GMF；NA來源于乙型流感病毒，其蛋白編號為1A4G。利用分子對接軟件，去除蛋白晶體結構中的相關配體，并對蛋白進行前處理，得到用于對接的潔凈蛋白結構并保存[18]。在PubMed數據庫中查找并下載牡荊素（編號CID5280441）、葒草素（編號CID5281675）、牡荊素- 2"-O-β-L-半乳糖苷（編號CID44257714）、葒草素- 2"-O-β-L-半乳糖苷（編號CID44257952）、藜蘆酸（編號CID7121）、金蓮花堿（編號CID11160309）的三維分子結構，進行能量優化并保存[19-20]。

2.2 蛋白前處理

TLR3：根據文獻[21]，以白藜蘆醇作為陽性藥確定活性位點，均方根偏差（RMSD）<2，確定蛋白活性口袋，結果見圖1a。TLR4：在DrugBank數據庫中以TLR4為關鍵詞搜索，獲得6種陽性藥物，分別為（R）-3-羥基十四烷酸（編號DB02767）、eritoran tetrasodium（編號DB04933）、golotimod（編號DB05475）、月桂酸（編號DB03017）、豆蔻酸（編號DB08231）、納洛酮（編號DB01183）；以這6種陽性藥物確定活性位點，RMSD均小于2，以納洛酮確定蛋白活性口袋，結果見圖1b。TLR7：在DrugBank數據庫中以TLR7為關鍵詞搜索，獲得4種陽性藥物，分別為golotimod（編號DB05475）、羥基氯喹（編號DB01611）、咪喹莫特（編號DB00724）、艾沙托立賓（編號DB04860）；以這4種陽性藥物確定活性位點，RMSD均小于2，以咪喹莫特確定蛋白活性口袋，結果見圖1c。NA：根據文獻[22]，以扎那米韋作為陽性藥確定活性位點，RMSD<2，確定蛋白活性口袋，結果見圖1d。

2.3 分子對接

使用Libdock程序進行分子對接。在參數設置過程中，將參數“Conformation Method”確定為BEST，其他參數采用軟件的默認設置[23]。經過Discovery Studio 2.5軟件運算分析，得到金蓮花中6種化合物牡荊素、葒草素、牡荊素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、藜蘆酸、金蓮花堿分別與TLR3、TLR4、TLR7、NA蛋白的對接信息。

2.3.1 Toll樣受體蛋白3

以白藜蘆醇作為陽性藥確定活性位點，RMSD<2，白藜蘆醇的打分值為95.490 9。以該數值的80%作為截斷值，即76.390 0。牡荊素、葒草素、藜蘆酸、金蓮花堿的打分值均高于76.390 0。化合物與TLR3結合的空間位置以及對接打分值見表1。

2.3.2 Toll樣受體蛋白4

以TLR4作為關鍵詞搜索DrugBank數據庫，獲得6種陽性藥物。以這6種陽性藥物確定活性位點，RMSD均小于2。陽性藥物納洛酮、Eritoran tetrasodium、golotimod、月桂酸、（R）-3-羥基十四烷酸、豆蔻酸的打分值分別為67.813 1、179.073 0、105.642 0、98.879 9、108.439 0、100.844 0。以陽性藥物中打分值最低的納洛酮的80%作為截斷值，即54.250 0。牡荊素-2"-O-β-L-半乳糖苷、藜蘆酸、金蓮花堿的打分值均高于54.250 0。化合物與TLR4結合的空間位置以及對接打分值見表2。

2.3.3 Toll樣受體蛋白7

以TLR7作為關鍵詞搜索DrugBank數據庫，獲得4種陽性藥物。以這4種陽性藥物確定活性位點，RMSD均小于2。陽性藥物咪喹莫特、羥基氯喹、艾沙托立賓、golotimod的打分值分別為89.812 6、104.584 0、116.549 0、126.082 0。以陽性藥物中打分值最低的咪喹莫特的80%作為截斷值，即71.850 0。牡荊素、葒草素、藜蘆酸、金蓮花堿、牡荊素-2"- O-β-L-半乳糖苷打分值均高于71.850 0。化合物與TLR7結合的空間位置以及對接打分值見表3。

2.3.4 神經氨酸酶

以扎那米韋作為陽性藥確定活性位點，RMSD<2，白藜蘆醇的打分值為121.087 0。以該數值的80%作為截斷值，即96.869 6。牡荊素、葒草素、牡荊素- 2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷的打分值均高于96.869 6。化合物與NA結合的空間位置以及對接打分值見表4。

3 討論

TLRs是機體免疫系統識別感知細菌、病毒等病原體入侵的重要分子，在機體免疫防御功能中發揮著重要作用，因此相關作用機制的研究倍受關注。在TLRs的信號傳導中，TLR4和TLR7通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴途徑即MyD88/IRAK/TRAF6的信號傳遞活化轉化生長因子激活激酶1（TAK1）和核因子-κB （NF-κB）信號通路，促進炎性因子等相關基因表達；TLR3和TLR4可通過MyD88非依賴途徑，即通過接頭分子TRIF或TRAM，最終引起NF-κB的活化和干擾素調節因子3（IRF3）的核轉位，調控炎性因子和干擾素的表達[24-26]。由對接結果可知，與TLR3、4、7對接打分值大于陽性藥物打分值80%的化合物分別有4、3、5個。與TLR3結合活性由大到小依次為：牡荊素>葒草素>金蓮花堿>藜蘆酸；與TLR4結合活性由大到小依次為：牡荊素-2"-O-β-L-半乳糖苷>藜蘆酸>金蓮花堿；與TLR7結合活性由大到小依次為：牡荊素>葒草素>牡荊素-2"-O-β-L-半乳糖苷>金蓮花堿>藜蘆酸。與3個靶點蛋白都有較高結合活性的化合物有2個，分別是藜蘆酸和金蓮花堿。金蓮花中的黃酮類（牡荊素、葒草素）、酚酸類（金蓮花苷、藜蘆酸）和生物堿類（金蓮花堿）都具有抗病毒和抗炎活性[5]，與梁經緯等[17]研究發現金蓮花堿具有抗菌作用的結果一致。根據本研究結果推測，這些化合物通過影響TLR3/4/7介導的信號通路發揮作用，TLR3、4、7可能是牡荊素、葒草素、牡荊素-2"-O-β-L-半乳糖苷、金蓮花堿、藜蘆酸抗病毒和抗炎作用的潛在靶點，而葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷與上述3種蛋白均無相互作用，初步推測其對TLRs介導的信號通路無影響[8，27]。

NA在病毒的復制和致病過程中起重要作用，神經氨酸酶抑制劑的研究與開發已成為尋找治療流感病毒藥物的研究熱點[28]。靳玉瑞等[29]提出黃酮類化合物對NA具有很好的抑制作用，分子模擬對接結果顯示，6個化合物中的4個黃酮類化合物（牡荊素、葒草素、牡荊素-2"-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷）均可與NA結合，并與陽性藥扎那米韋的作用位點接近，可初步推測其對NA具有抑制活性，可作為抗流感病毒的潛在藥物。酚酸類（金蓮花苷和藜蘆酸）和生物堿類（金蓮花堿）與NA無相互作用，初步推測其不影響流感病毒中的NA的作用。

目前金蓮花抗病毒和抗炎機制尚不明確。本研究以多個靶點對金蓮花中6種成分進行篩選，結果顯示，金蓮花不但存在單個成分與多個靶點的作用，而且存在不同成分與同一靶點的作用，表明金蓮花抗炎和抗病毒作用可能涉及多成分、多靶點、多通路之間的協同作用。本研究可以深化對金蓮花主要化學成分生物活性的認識，為探討金蓮花的抗病毒和抗炎有效成分及其作用機制提供依據。但本研究結果僅是根據這些化合物結構進行預測得出的，需要通過體內外實驗對其抗病毒和抗炎活性和機制進一步驗證。

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