正交試驗優化養心安神顆粒提取工藝

曹麗萍 梁奇 李曙光 謝月 張子龍 楊光義

摘要：目的 優化養心安神顆粒提取工藝。方法 以揮發油得率為指標，采用單因素試驗考察加水量、浸泡時間、提取時間對揮發油得率的影響；以加水量、提取時間、提取次數為考察因素，以提取液中芍藥苷和總固形物含量為綜合評價指標，采用正交試驗設計優化養心安神顆粒的提取工藝。結果 最佳提取工藝為：桂枝、防風、佛手加8倍量水，蒸餾6 h提取揮發油；其余藥味加8倍量水煎煮1 h，提取2次。結論 該提取工藝合理可行，并能較好保證制劑質量。

關鍵詞：養心安神顆粒；揮發油；芍藥苷；總固形物；高效液相色譜法；正交試驗；提取工藝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.019

中圖分類號：R283.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0079-04

Abstract： Objective To optimize the extraction technology for Yangxin Anshen Granules. Methods With yield of volatile oil as index， single factor tests were adopted to investigate effects of water， soaking time and distillation time on extraction technology of volatile oil. Using water amount， extraction time and extraction times as factors， the contents of paeoniflorin and total solid as indexes， orthogonal test was employed to optimize the extraction technology of Yangxin Anshen Granules. Results The optimical extraction technology conditions were as follows： Cinnamomi Ramulus， Saposhkoviae Radix， and Citri Sarcodactylis Fructus were extracted to get volatile oil with eight-folds amount water of herbs for 6 hours； other herbs were boiled with eight-folds amount water of herbs and extrancted for two times， 1 h each time. Conclusion This extraction process is reasonable and practical， and can well guarantee the quality of preparation.

Keywords： Yangxin Anshen Granules； volatile oil； paeoniflorin； total solid； HPLC； orthogonal test； extraction technology

養心安神湯為深圳市寶安區中醫院臨床應用多年的經驗方，由白芍、大棗、麩炒白術、防風、桂枝、煅龍骨等14味中藥組成，具有養心安神、調和營衛的功效，用于治療睡眠不安、多汗等證。由于顆粒劑具有攜帶和使用方便、穩定性好等優點，故將其改劑型為養心安神顆粒。本研究在原湯劑水提工藝基礎上對提取工藝進行優化，初步確定其制備工藝為：桂枝、佛手、防風采用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，揮發油備用，蒸餾后的水溶液備用；白芍等其余11味藥加水煎煮，煎煮液與上述蒸餾后的水溶液合并，合并后的藥液經純化后制粒，將揮發油噴入顆粒中，混勻，即得。本研究以揮發油得率為指標，采用單因素試驗優選揮發油提取工藝條件，以加水量、提取次數、提取時間為影響因素，以芍藥苷和總固形物含量為評價指標，采用正交試驗優化水提取工藝，為養心安神顆粒的進一步研究與生產提供依據。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；Sartori?s BP 211D型電子分析天平，德國Sartorius公司；101-1BS電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博泰公司。

芍藥苷對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號110736-201539，純度96.4%；水為超純水，乙腈為色譜純，德國默克公司；其他試劑均為分析純；白芍、大棗、麩炒白術、防風、桂枝、煅龍骨、煅牡蠣、山萸肉、醋五味子、浮小麥、燈芯草、合歡皮、佛手、甘草飲片，深圳市宏順昌藥業有限公司提供，經深圳市中醫院藥檢室鑒定均符合2015年版《中華人民共和國藥典》標準。

2 方法與結果

2.1 單因素試驗優化揮發油提取工藝

采用單因素試驗，以揮發油得率為指標，對加水量、浸泡時間、提取時間進行優選。經預試驗，所得揮發油比重<1.0，按揮發油測定法（2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則2204）甲法提取揮發油。

2.1.1 加水量考察

按處方比例稱取桂枝、防風、佛手飲片，每份1150 g，分別加入6、8、10、12倍量水，浸泡1 h，蒸餾提取揮發油8 h，測定揮發油量，計算揮發油提取率，結果見表1。可見，加8倍量水的揮發油提取率接近最大值，同時考慮大生產和成本等因素，確定加8倍量水提取揮發油。

2.1.2 浸泡時間考察

按處方比例稱取桂枝、防風、佛手飲片，每份1150 g，加入10倍量水，浸泡0、0.5、1、2 h，提取揮發油8 h，測定揮發油量，計算揮發油提取率，結果見表2。可見，隨著浸泡時間的延長，揮發油提取率無明顯增加，考慮大生產和成本等因素，選擇不浸泡，直接提取。

2.1.3 提取時間考察

按處方比例稱取桂枝、防風、佛手飲片，每份1150 g，分別加入8倍量水，每隔1 h記錄揮發油體積，計算揮發油得率，結果見表3。可見，提取時間對揮發油收率有明顯影響，隨著時間的延長，揮發油提取率明顯增加，但提取6 h與8～10 h比較，揮發油提取率相差不大，同時考慮大生產和成本等因素，確定揮發油提取時間為6 h。

2.1.4 揮發油提取工藝驗證試驗

稱取桂枝、防風、佛手飲片共3份，每份1150 g，加8倍量水，蒸餾回流提取6 h，揮發油提取率分別為0.067%、0.065%、0.065%，平均0.065%，RSD=0.25%，表明該提取工藝穩定、可行。

2.2 芍藥苷含量測定

除桂枝、防風、佛手外，白芍等其余11味藥加水煎煮，煎煮液濃縮至500 mL，作為供試品貯備液，供芍藥苷含量測定和總固形物測定用。

2.2.1 色譜條件及系統適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）為流動相，檢測波長為230 nm。理論塔板數按芍藥苷峰計算應不低于2000。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備

取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含109.3 ?g芍藥苷的對照品貯備液，分別精密量取對照品貯備液1、2、4、6、8、10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成系列對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密量取正交試驗各供試品貯備液2 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.2.4 線性關系考察

取系列對照品溶液，按上述條件分別進樣10 ?L，測得峰面積。以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得標準曲線回歸方程為Y=12 515.048 2X-6681.463 0，r=0.999 9，結果表明芍藥苷在10.93～109.3 ?g/mL范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗

取芍藥苷對照品溶液連續進樣6次，每次10 ?L，測定峰面積，RSD=0.52%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗

按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于放置0、2、4、8、12 h進樣測定芍藥苷峰面積，結果RSD=0.76%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗

取同一供試品貯備液6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣，測定芍藥苷含量。結果供試品貯備液中芍藥苷平均含量為256.7 ?g/mL，RSD=0.77%，表明重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

取已知芍藥苷含量（256.7 ?g/mL）的貯備藥液，共9份，每份1 mL，分別加對照品溶液（109.3 ?g/mL）2 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，結果芍藥苷平均回收率為99.7%，RSD=1.4%，見表4。

2.2.9 含量測定

精密量取對照品溶液、供試品溶液各10 ?L，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定藥液中芍藥苷含量。

2.3 總固形物測定

精密量取供試品貯備液100 mL，置干燥至恒重的蒸發皿，濃縮至干，于105 ℃干燥至恒重，得干膏，計算總固形物。

2.4 正交試驗優化水提工藝

2.4.1 試驗設計及結果

采用正交試驗優化白芍等11味藥的水提工藝。以加水量、提取次數、提取時間為影響因素，每個因素設3個水平，選用L9（34）正交表，試驗安排及結果見表5～表7。

由極差R可知，提取次數對芍藥苷提取量的影響最大，各因素影響大小順序為：提取次數（C）>加水量（A）>提取時間（B）。方差分析表明，因素C（提取次數）對試驗結果有顯著影響（P<0.05），因素A（加水量）和因素B（提取時間）對試驗結果無顯著影響（P<0.10）。故選擇提取工藝為A1B1C2，即：提取2次，每次加8倍量水，每次提取1 h。

2.4.2 水提工藝驗證試驗

取上述飲片共6份，按優選的提取工藝，即每次加8倍量水煎煮1 h，共煎煮2次，過濾，合并濾液，濃縮至250 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定芍藥苷含量，按“2.3”項下方法測定總固形物，結果芍藥苷平均121.0 mg，總固形物平均25.3 g，見表8。表明按優選的工藝進行提取，芍藥苷和總固形物含量接近最大值，該工藝合理可行。

3 討論

白芍為方中君藥，具有養血、斂陰止汗的功效[1]，其發揮藥效的物質基礎是單萜及其苷類、三萜類和多糖等化合物，主要有效成分是芍藥苷，具有抗自由基損傷、抑制細胞內鈣超載和抗神經毒性等活性，能降低血液黏度、抗血小板聚集，保護神經等[2-6]。

方中佛手、桂枝、防風均含有揮發油活性成分[7]。夏倫祝等[8]通過不同方法提取防風揮發油，出油率為0.77%～5.23%。趙興杰等[9]提取佛手揮發油，得率為0.3%～1.19%。桂枝揮發油含量為0.2%～0.9%，其主要成分為桂皮醛，桂枝對大鼠中樞神經系統具有鎮靜和抗焦慮作用，桂皮醛可縮短大鼠睡眠潛伏期，增加睡眠持續時間[10]；防風揮發油協同色原酮等其他成分發揮解熱、鎮靜、鎮痛、抗炎等作用[11]；佛手揮發油具有止咳平喘祛痰、抗氧化、免疫調節等作用[12]。故本研究在原湯劑的基礎上增加揮發油的提取，減少有效成分的損失。

芍藥苷藥效具有代表性，故選為主要指標，綜合評分權重定為60%[13-15]。總固形物中其他成分對本方功效共同發揮作用，故設定總固形物權重為40%。

本研究通過芍藥苷及總固形物含量進行綜合評價，采用L9（34）正交試驗優化養心安神顆粒提取工藝，較好地保證了制劑質量。最終確定的提取工藝為：桂枝、佛手、防風加8倍量水，提取6 h，蒸餾后的水溶液另器收集；白芍等其余11味加水煎煮3次，每次加8倍量水，每次1 h。驗證試驗表明該工藝穩定可行，為養心安神顆粒的研制和生產提供了依據。

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