雞β —防御素7的克隆與表達

張開娟 云驁 楊猛 盧艷 王文華

摘要：防御素在抗生素取代方面有良好的發展前景，但目前在防御素大規模表達方面仍有難點。本實驗著重探究如何實現防御素的大規模表達。實驗通過設計目的基因引物、PCR擴增目的基因、將雞8防御素7（AvBD7）基因克隆到大腸桿菌BL21表達載體質粒pET32a中、擴增大腸桿菌、對雞AvBD7基因進行鑒定、分離純化目的蛋白并進行檢測的過程方法，完成重組雞AvBD7基因的克隆與表達，得到雞AvBD7基因可以在大腸桿菌BL21中表達的結論，為雞AvBD7基因的進一步臨床應用打下基礎。

關鍵詞：β-防御素；原核表達；蛋白質誘導表達；蛋白質檢測

中圖分類號：S8 31.2

文獻標識碼：A

文章編號：2095-9737（2018）06-0001-04

防御素是一種具有廣譜高效的抗微生物活性[1]和非特異性細胞毒作用及調節體內適應性免疫的陽離子活性肽[2]，具有獨特的抗菌機理。早在1965年由Hrish等首次從兔的PMN中提取出1種具有殺菌活性的陽離子蛋白，稱為“吞噬素”，之后Zeya和Spitznageleta發現此陽離子活性蛋白富含精氨酸和半胱氨酸，并將其命名為“溶酶體陽離子蛋白”[3]。20世紀80年代，Ganz等由于其廣譜的抗微生物活性首次將其命名為“防御素”，且Evans首次從雞的異嗜性白細胞中分別純化得到Ga-ll～2[4]，之后國際統一將防御素命名為AvBD。8防御素最先從牛的支氣管黏膜上皮細胞中分離得到，雞中的防御素均為β-防御素，β-防御素7主要分布于雞的骨髓[5-6]。

防御素相對分子質量較小，熱穩定性和水溶性均較好，可以在腸道內吸收，且防御素屬于多肽成分，在體內容易被蛋白酶降解為氨基酸，動物采食后在體內一般無殘留，故在畜牧業中有良好的應用前景。但防御素在雞體內含量較低，對其進行提取純化不僅在技術上有一定的難度，而且若想獲得大量的目的蛋白，需要投入大量的人力物力。通過基因工程可實現防御素的大量表達，使其成為一種不易使病原微生物產生耐藥性的、具有良好前景的“抗生素替代品”[7-8]，減少抗生素廣泛運用帶來的危害。基于雞β-防御素1—6的研究基礎，本實驗選用遺傳背景清楚、生長繁殖快、轉化效率高、成本低廉的大腸桿菌表達系統對雞AvBD7基因進行初步研究，完成雞AvBD7基因的克隆與表達。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗菌種及質粒載體：菌株大腸桿菌BL21、質粒載體pET32a由山東農業大學動物分子病理實驗室提供。

主要試劑：限制性內切酶EcoR I、Not I、T4DNA連接酶、TaKaRAa DNA marker購于寶生物公司，質粒提取、PCR產物純化試劑盒與RNA提取試劑盒購于天根公司，SDSPAGE凝膠快速配置試劑盒（產品編號：P0012AC）購于碧云天公司。

主要儀器：PCR儀購于Eppendorf公司，恒溫培養箱與超凈工作臺購于上海博訊公司，凝膠成像系統購于北京君意公司，恒溫搖床購自上海申能博彩公司，細胞超聲波粉碎機購于寧波新芝生物有限公司，SDS- PAGE電泳槽購于北京六一公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設計與合成

根據Genbank中登記的雞AvBD7基因序列（登錄號NM_ 001001194.1），應用Premier5.o軟件設計一對引物。AvBD7 F的5端有EcoRI酶切位點，AvBD7 R的5端有NotI酶切位點。設計好的引物由華大基因科技公司合成。PCR擴增所用引物（見表1）。

1.2.2

PCR擴增雞AvBD7基因序列

以雞AvBD7基因序列為模板，用合成的引物擴增出雞AvBD7基因序列。PCR反應步驟：94℃變性5 min；開始將下面三個步驟進行32個循環：變性（94℃，40 s），退火（59℃，30 s），復性（72℃，l min）；最后72℃反應10 min。得到的PCR產物進行凝膠電泳。切下含雞AvBD7基因條帶的膠塊進行純化后送華大公司測序。

下面是含雞AvBD7基因膠塊純化的步驟（使用前先在漂洗液PW中加入無水乙醇，加人體積參照瓶上的標簽）。

柱平衡步驟：本步驟需要使用當天處理過的柱子。向放人收集管中的吸附柱CA2中加入500 μL平衡液BL，12000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放人收集管中。

將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，注意要盡量切除多余部分。將條帶放人干凈的離心管中，稱取重量。

向膠塊中加入等倍體積溶液PN。如果凝膠重為0.lg，其體積可視為100 μL，則加入100 μL PN溶液。將體系于50℃水浴放置，其間不斷溫和的上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解，若還有未溶的膠塊，則繼續放置幾分鐘或再補加一些溶膠液，直至膠塊完全溶解。膠塊體積過大時，需事先將膠塊切成碎塊。

將上一步所得溶液加入置于收集管中的吸附柱CA2中，室溫放置2 min，12000 r/min離心30～60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。吸附柱容積為800μL，若樣品體積大于800 μL，需分批加入。

確認已加入無水乙醇后，向吸附柱CA2中加入600 μL漂洗液PW，12000 r/min離心30～60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。

重復上一步操作步驟。

將吸附柱CA2放回收集管中，12000 r/min離心2 min，盡量除盡漂洗液，再將吸附柱CA2置于室溫放置數分鐘，徹底的晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步實驗。

將吸附柱CA2放于一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液BE，室溫放置2 min，12000 r/min離心2 min收集DNA溶液。進行后續測序時，需使用ddH20做洗脫液，并保證其pH值在7.O～8.5范圍內，pH值低于7.0會影響洗脫效率。另外DNA產物應該保存在 20℃，以防DNA降解。DNA也可以用緩沖液（lOmMTris- Cl，pH8.o）洗脫。為了提高DNA回收量，需將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，室溫放置2 min，12000 r/min離心2 min，將DNA溶液收集到離心管中。

1.2.3 重組雞AvBD7基因表達載體的構建

PCR擴增產物經純化后用EcoRI和NotI雙酶切，酶切后對其進行回收純化，然后與經雙酶切并純化的質粒pET32a連接，轉化BL21感受態細胞并用具有氨芐青霉素的平板篩選轉化子，轉化子在平板上生長出兩個菌落，搖菌擴增之后，分別進行菌落PCR，所用引物與目的基因引物相同。經測定，兩個菌落均成陽性，但其中一個菌落條帶更加明亮。選取此菌落轉化子進行后續實驗。將陽性菌送華大基因公司測序，并將連接轉化菌體序列與實驗PCR所得基因序列作對比。

雞AvBD7基因雙酶切反應體系和連接轉化反應體系（見表2、表3）

1.2.4重組雞AvBD7基因的誘導表達與提取純化

將測序正確的菌株接種于100 mL LB液體培養基中，37℃恒溫搖床培養至渾濁后加入蛋白誘導劑IPTG，繼續培養一段時間，收集菌體，超聲破碎，收取沉淀和上清液分別做SDS- PAGE，確定其蛋白表達是在沉淀包涵體中。然后再經過條件優化摸索出最佳誘導的IPTG濃度及時間，從而提高蛋白的表達，即將AvBD7載體菌擴增至OD=0.6，加入蛋白誘導劑IPTG使其終濃度為1 mmol/L，37℃恒溫搖床繼續培養6h，分別取加入IPTG后Oh、2h、4h、6h4個時間節點的菌體，超聲破碎，取包涵體并進行包涵體純化后，進行SDSPAGE檢測。檢測雞AvBD7基因的誘導表達情況。

包涵體的提取與純化步驟：將大量表達的菌液收集并分裝入lOmL離心管，4℃，8000 r/min，離心25 min；根據收集菌量加PBS重懸菌液，分裝于1.5 mL的EP管。用超聲破碎儀破碎大腸桿菌，4℃，12000 r/min，離心15 min，棄上清液。用9倍體積的洗滌液I重懸沉淀，室溫靜置5 min；12000 r/min，15 min，棄上清液。用9倍體積的洗滌液Ⅱ重懸沉淀，室溫靜置5 min；12000 r/min，15 min，棄上清。用9倍體積的洗滌液重懸沉淀，室溫靜置5 min；12000 r/min，15 min，棄上清。按照100 mL菌液加4 mL溶解液的比例加入溶解液充分溶解th后，12000 r/min，15 min，所得上清液就是溶解的包涵體。

2 結果

2.1 PCR獲得雞AvBD7基因

PCR擴增得到約300bp的雞AvBD7基因序列，如圖1。雞AvBD7基因大小是514bp，PCR所得雞AvBD7基因包含編碼區的基因片段。

PCR所得雞AvBD7基因與從Genbank中所獲得的基因符合度較高，CDS區完全一致，如下圖2、3。

2.2 成功構建重組雞AvBD7基因表達載體

獲得EcoRI和Notl雙酶切并回收純化的PCR擴增產物，如圖4。

表達載體質粒pET32a雙酶切，如圖6。

對大腸桿菌BL21轉化子進行菌落PCR，得到兩個陽性菌落，如圖5。

連接轉化菌體序列與實驗PCR所得基因序列作對比，可見雞AvBD7基因已正確連接到菌體中，如圖7。

2.3 完成重組雞AvBD7基因的誘導表達與提取純化

雞AvBD7成熟肽表達的大小在6kb左右，但本實驗重組表達的雞AvBD7基因因與his標簽的共同表達，故大小約在20kb。如圖可見蛋白在沉淀中表達較多，可證明蛋白是在包涵體中表達，如圖8。

獲得時間梯度下，經IPTG誘導的蛋白表達，由圖可見，雞AvBD7蛋白表達量隨時間梯度變化，且在4h表達的最多，如圖9。

3 討論

調查發現，在家禽的集中化養殖模式中，抗生素被廣泛應用。然而長期使用抗生素會使禽群的耐藥性提高，且抗生素易在家禽體內殘留，不利于養殖業健康的發展。之前的研究表明防御素具有廣譜高效的抗微生物活性和獨特的抗菌特性，可以避免禽群耐藥性的產生，且作為一種天然抗菌肽，防御素也不存在藥物殘留的問題，可以有效提高農產品的安全性[9]，由此可見，防御素具有極高的研究意義。但天然防御素在動物體內含量少且提取操作較為復雜，成本高，若利用基因工程手段構建防御素基因表達載體，將載體轉入合適的宿主表達細胞，便能大量生產防御素，為防御素的廣泛利用提供有效的途徑[10]，因此防御素在基因工程上具有很大的發展潛力。

實驗通過查閱文獻獲得防御素的基本信息，確立了對雞AvBD7基因的研究方向，根據Genbank中登記的雞AvBD7的基因序列設計出引物并使用質粒pET32a完成雞AvBD7基因表達載體的構建，利用轉化效率高且成本低廉的大腸桿菌原核表達系統，成功誘導蛋白質表達并運用SDS - PAGE完成了對表達產物的測定。由實驗可得，100 mL LB菌液可得到4 mL濃度為100～200 μg/mL的蛋白質溶液。為保證實驗成功，實驗操作中有許多需要注意的地方，例如在雞AvBD7基因膠體純化步驟中，洗脫液體積不應小于30 μL，體積過小影響回收效率，且需要嚴格控制洗脫液的pH值來保證洗脫效率。

未來需要進一步對雞AvBD7基因的作用進行探究，例如對其在抗菌抑菌、抗腫瘤效果及其臨床應用等方面進探究，去發現當前未被發現的性能，挖掘其更大的功能意義，使雞AvBD7基因的實際應用價值的得到更大的提升。

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