大型海藻組織培養研究進展

徐睿航 張國庚

[摘 要] 本文首先對大型海藻的組織培養歷史研究成果進行介紹，然后分析海藻組織培養存在的問題，最后從培養方法、取材、培養基、生長條件等方面對海藻組織培養的相關技術及相關研究進行總結。

[關鍵詞] 大型海藻；組織培養；取材；培養基；生長條件

[中圖分類號] Q943.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-7909（2018）05-89-3

海藻在海洋植物中占有很重要的地位，而大型海藻是海藻中非常重要的組成部分，主要的經濟大型藻類包括紅藻、綠藻、褐藻等多個門類。大多數藻類的經濟價值較高，可以用作食品、一些藥物的原料，也可用作動物飼料等，甚至是可以提煉工業原料，如角叉膠、瓊脂、早酸鹽、卡拉膠等。盡管我國在海藻研究方面人數較少且起步相對比較晚，但是在經濟海藻的應用研究方面如紫菜體細胞育苗上已經達到國際領先水平[1]。為了有效提高海藻作物的產量，要盡快實現海藻組織培養的產業化，突破海藻組織培養的瓶頸，快速生產市場上缺少的商品苗。

1 歷史研究情況

20世紀50年代，海藻組織培養的研究開始興起。1952年，Aharon Gibor開始著手對囊鏈藻Cystoseira組織培養進行研究[2]。二十世紀七八十年代，海藻組織培養技術發展比較迅猛。1978年，有學者運用無菌培養技術對皺波角叉菜（Chondrus crispus）髓部組織進行培養，并獲取其愈傷組織誘導分化形成完整植株，取得不小的研究成果[3]。20世紀80年代，植物組織培養發展最為迅速，很多研究人員相繼通過海藻組織培養得到相應的孢子體。20世紀末，隨著分子生物學與細胞生物學的不斷發展，海藻組織培養技術因此也增加了許多鑒定及分析方法，對其有著極大的影響。同樣，隨著固定化技術、基因工程、細胞雜交等一系列生物技術的發展，藻類生物技術同樣飛快進步著。羊棲菜（Sarqassum fusiforme）假根育苗等技術也為藻類育苗提供了新的方法[4，5]。

2 海藻組織培養存在的問題

現在的主要問題是對控制海藻細胞成長與分化等方面知識較缺乏，導致很難控制組織、細胞愈合組織或細胞的發育。并且截至目前，依然無法得到合適的、準確的海藻培養基。

另外，早期組織培養的問題是無菌材料的獲取，無法有效獲取無菌組織導致在培養過程中細菌快速生長而抑制藻類組織的生長，甚至會殺死培養組織。截至目前，大型海藻的無菌取材、操作及培養仍是一個難以跨越的瓶頸。在無菌條件下培養的藻類，多數個體最終都不能正常生長，其中最易發生的情況就是植株發育畸形。但是，如果在培養過程中加入某些被分離的細菌或其他污染物時，藻類恢復正常生長。這說明在那些被分離的污染物中包含能使藻類正常生長的物質，但目前還沒有成功分離出相應的物質，并且對這些物質的鑒定也并不完全成熟[6]。

3 相關技術研究

3.1 培養方法

大型海藻的組織培養主要是培養大型海藻生活史中的微觀階段，如配子、配子體和孢子等。根據培養目的的不同，可以將培養方法分為以下三類：一是粗培養，就是在培養過程中將多種藻混在一起進行培養，并且包含細菌的培養；二是單藻培養，即在培養過程中僅存在一種藻類，但是單藻培養過程中培養基中會含有細菌；三是無菌培養，即在培養過程中只培養一種藻，并且沒有細菌污染[7]。

3.2 取材

3.2.1 取材部位。在組織培養過程中，其生長活力或者產生的愈傷組織的不同，有很大一部分原因是培養的組織塊的取材位置不同。因此，選擇比較合理、準確的培養材料是非常重要和必要的。1977年，Saga等[8]在海帶的葉片、假根、莖的切段再生試驗中，發現有再生能力的部位僅僅是離基部較近的一段區域（包括柄和假根）。方宗熙等[9]對海帶和裙帶菜孢子體兩者不同部位的再生能力進行了試驗，結果發現雙方皆是葉片基部切塊經愈傷組織長出的孢子體的數量最多，其次是葉片中部。而對于羊棲菜芽生苗出苗率而言，最高的是假根，之后是主干中上部，最后是下部[9]。不同部位的組織塊生長發育狀況不同的現象同樣出現于條斑紫菜離體組織再生苗的研究試驗中[10]。同樣，鼠尾藻不同部位的分生能力也是各不相同，其中最強的是固著器的外植體，其次則是主莖，而枝與葉的形態發生活性很差[11]。

3.2.2 滅菌處理。滅菌的程度就是既要殺滅外植體所帶的細菌，又不能對外植體有所損害。常用的消毒試劑如表1所示。

3.3 培養基的制備

3.3.1 培養基的種類。培養基是根據材料和培養目的的不同來選擇的，高等植物的培養基主要有MS培養基（Murashige和Skoog，1962）、ER培養基（Eriksson，1965）、B5培養基（Gambor等，1968）、SH培養基（Shenk和Hildebrandt，1972）和HE培養基（Heller，1953）。而海藻與高等植物有一定的區別，故在培養基的選擇上也有所不同，主要有培養褐藻的PESI培養基、MES培養基、PES培養基、VAS培養基，其中PES培養基主要培養紅藻和綠藻，還有就是Erd（-shreiher）培養基和ESS培養基，這兩種培養基主要用于培養一般海藻。這些培養基在組成成分上是有所不同的。除了化學成分外，培養基的物理因素在培養過程中所造成的影響也是不能忽視的。比如，固體培養基對于誘導愈傷組織的形成是比較有利的，而細胞和胚狀體的增殖則在液體培養基中更容易進行。

3.3.2 植物激素。培養基中除了那些必不可少的營養物質外，其他植物生長調節劑及其他植物激素也尤為重要。植物激素的添加在藻類組織培養中一直是個難題。對于大型海藻的組織培養而言，植物激素對其愈傷組織的分化以及后期植株的形成與發育都是十分重要的。一般細胞分裂素對于誘導細胞脫分化形成愈傷組織是非常有利的，較高的細胞分裂素與生長素之比有益于芽的形成，較高的生長素和細胞分裂素之比有利于根的形成。但是，由于植物激素與組織分化之間的相互作用和植物基因的遺傳表達有著非常緊密的關系，所以有時甚至會出現相反的結果。研究表明，多胺類、油菜素甾醇類、三十烷醇等化合物也具有植物生長調節劑活性[12]。

另外，激素的種類和濃度的不同對海藻組織塊的發育和生長同樣有著不同的影響。比如，6-BA和2，4-D在條斑紫菜組織培養過程中的作用就不同[13]。吲哚乙酸和脫落酸在海帶中不同部位不同時期的分布對其生長發育有著不同的影響，對此，李鐵松對其關系進行了研究測定[14]。

3.4 生長條件

培養條件的不同對之后培養的過程及結果會有很大的影響。一是光照條件。通常應用日光燈，一般光照強度控制在15～40 μmol/（m2·s），每天的光照時間在12～16 h。二是溫度條件。不同的植物體在自然環境中所適合的溫度不同，要根據不同植物體在自然環境中所適宜的生長溫度來適當調整培養溫度，通常在15～25 ℃。三是濕度條件。不僅僅是培養容器中的濕度對培養有影響，培養環境的濕度對培養也有影響，所以要同時注意這兩方面的濕度條件。四是充氣條件。在液體培養基中，培養時可以通過充氣的方式來達到攪拌培養的效果。在通入空氣時，要對通入的空氣進行加工，需要經過濾膜孔徑為0.22 μm的過濾裝置，以此來保證培養過程無菌。此外，可以利用硫酸銅溶液去除其他藻類和雜菌，以避免培養過程被污染。五是培養液的更換。要根據培養要求及培養對象的不同按規定更換適量的培養液。需要注意的是，海水培養液由于蒸發的原因會使鹽度有所增加，因此，應根據蒸發量每天定量補加蒸餾水。例如，1997年Saga等[15]用海帶藻體分別進行假根、莖、葉片切段再生試驗，結果表明只有在靠近基部（包括假根、柄）部分才有再生能力。培養條件為用PESI培養液培養，光照周期為10L∶14D，溫度為10 ℃，光照強度30 μmol/（m2·s）。

4 結語

雖然目前海洋組織培養在組織塊的無菌培養及植物生長調節劑的研究方面存在不足，但在海藻組織培養領域已經取得了不小的成就。隨著今后基因工程、細胞雜交、固定化等技術的發展和成熟，對藻類的組織培養是很有利的，對藻類的育苗、快速繁殖、相應活性物質的提取研究及產業化生產都是十分可觀的?？傊?，藻類組織培養技術在今后一定會得到更加廣泛的應用。

參考文獻

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[15]Saga N，Uchida T，SskaiY. CloneLam inaria frum simgle isolated cell[J].Bull. Japanese Soc. Phyeol.，1978（44）：87.