HPLC梯度洗脫測定黃芪葉中鼠李檸檬素葡萄糖苷的含量

【摘 要】 目的：建立HPLC梯度洗脫測定黃芪葉中量大成分鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量。方法：HPLC法；色譜柱：Diamonsil-C18（5?m， 4.6nm×250nm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～45min， 10%A→85%A），流速1.0mL·min-1，檢測波長266.9nm，柱溫25℃。結果：鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷在2.1～33.0?g范圍內呈良好線性關系（r = 0.9999），平均加樣回收率（n=9）99.3%，RSD=1.35%；6批黃芪葉中鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷平均含量為0.44%。結論：該方法準確、簡單、具有良好的重復性和穩定性，為黃芪葉質量控制提供了科學的依據。

【關鍵詞】 黃芪葉；含量測定

黃芪葉具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗病毒、能有效的保護肝臟，降血糖等作用[1]。葉中主要含黃酮和皂苷類成分[2]。本文建立了黃芪葉中鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷含量測定方法，并比較6個批次黃芪葉鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量，為評價黃芪葉的質量控制和綜合開發利用提供了科學依據。

1 實驗儀器、材料和試劑

1.1儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，四元梯度泵，2996型PDA檢測器；梅特勒AL204天平（Mettler-Toledo Group）；梅特勒AB265-S天平（Mettler-Toledo Group）。

1.2試藥

鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷由實驗室自制，結構經MS、IR和NMR確證，HPLC （峰面積歸一化法）純度>98.5%；甲醇（色譜純，Dikma公司）；水為超純水；其余試劑為分析純。

黃芪葉于2010年采集于黑龍江省大興安嶺，經黑龍江中醫藥大學王振月教授鑒定為膜莢黃芪的干燥葉。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制

精密稱取對照品鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷4.13mg置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并加至刻度，搖勻，配制成0.413mg/mL鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷的對照品液。

2.2 供試品溶液的制備

取黃芪葉，粉碎，過4號篩，精密稱取約2.0g，置圓底燒瓶中，精密加甲醇50mL，稱定重量，加熱回流4個小時，放冷，再稱定重量，甲醇補足減少的重量，混勻，濾過，精密取續濾液25ml，收干溶劑，殘渣加甲醇溶解，轉移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即為供試品。

2.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18（5?m， 4.6nm×250nm）；流動相：甲醇（A） -水（B），梯度洗脫（0～45min， 10%A→85%A），流速1.0mL·min-1，檢測波長266.9nm，柱溫25℃。理論塔板數按鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷計算，不低于6000。對照品與樣品的色譜圖見圖1。

2.4 標準曲線制作

分別精密吸取“2.3”項下對照品溶液5、10、20、40、80?L，注入高效液相色譜儀，測定。以峰面積Y對進樣量X進行線性回歸，獲得回歸方程Y=3000000X-750318，r=0.9999，表明鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷在2.1～33.0?g時呈良好的線性關系。

2.5 精密度

精密吸取對照品10μL，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，結果鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷RSD=0.98%。說明精密度高。

2.6 重復性

精密稱取同一批次供試品黃芪葉約2.0g共6份，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.3”項色譜條件進樣10μL，測定。記錄峰面積，結果鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷含量的平均值為4.39mg/g，RSD=1.3%。說明此方法重復性良好。

2.7 穩定性

取“2.2”項下供試品溶液，室溫放置0，2，4，12，18，24 h后，按“2.3”項色譜條件進行HPLC分析，記錄峰面積，結果RSD（n=6）為1.12%，結果表明供試品溶液在24h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，置5ml容量瓶中，配成濃度為2.21mg/ml的對照品儲備液，精密稱取同一批次的黃芪葉樣品約0.5g，共9份，根據樣品中含鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷量的50%，100%，150%，分別向樣品中加入2.21mg/ml對照品液0.5，1.0，1.5mL，各3份，按“2.2”項下方法制備供試溶液，照“2.3”項下色譜條件進樣分析，測定，計算加樣回收率平均值為99.3%（n=9），RSD為1.35%。

2.9 樣品含量測定

分別取6個批次的黃芪葉，按“2.2”項制備供試品溶液，各3份，按“2.3”項色譜條件進行HPLC分析，進樣量10?L，記錄峰面積，結果見表1。

參考文獻

[1] 黃賢榮， 梁愛君， 黃忠， 等. 黃芪莖葉藥理作用研究進展[J]. 解放軍藥學學報， 2012， 28（3）：264-270.

[2] 陳虎虎， 龔蘇曉， 張鐵軍， 等. 黃芪莖、葉的化學成分和藥理作用研究進展[J]. 藥學評價研究， 2011， 34（2）：134-137.

通訊作者：馬振平， 女（漢族）， 碩士，藥師