水蛭素的分離純化研究進展

于曉敏 孟天嬌 崔慶本??

摘 要： 水蛭素（Hirudin）是水蛭唾液腺分泌物中的一種蛋白，是迄今為止發現的最強的天然凝血酶特效抑制劑，具有活血化淤的作用。但水蛭軀體中存在無抗凝活性的偽水蛭素組分和分泌物中大量成分復雜的物質，增加了水蛭素分離純化難度；臨床運用對生物制品的純度要求高，世界各地很多科學家對水蛭素的提取和純化做了許多相關的研究。本文對水蛭素分離純化方法進行了綜述，比較了多種方法的優勢與不足，為其分離純化工藝的進一步優化提供參考。

關鍵詞： 水蛭素；分離；純化；

【中圖分類號】 R285.5 【文獻標識碼】 A 【文章編號】 2236-1879（2018）11-0256-01

水蛭是傳統的中藥材，早在《神農本草經》就有記載，具有破血、逐淤、通經的功效。 水蛭中有效成分為水蛭素，是目前已知的一種高效的、特異的、最強的凝血酶抑制劑水蛭素具有抗凝血和溶解血栓的作用，在治療心腦血管疾病、動脈粥樣硬化、敗血休克、高血壓及缺少抗凝血酶Ⅲ因子的疾病等方面具有巨大的優越性和廣闊的應用前景。

1水蛭素的理化性質

水蛭素干燥狀態下穩定，室溫下水中可穩定存在6個月，80℃下加熱15min而不被破壞。PH值升高或降低均會導致穩定性下降，在0.1mol/L鹽酸溶液或0.1mol/L氫氧化鈉溶液中可穩定15min。水蛭素不能被胰蛋白酶水解，對α-糜蛋白酶也有一定的耐受性，其原因在于水蛭素存在一個由3個二硫鍵組成的不易被降解的N-端結構。但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶A則可使之失去活性。

2 水蛭素的分離與純化

2.1. 天然水蛭素的分離與純化。

天然水蛭素產生于水蛭的唾液里， 水蛭吸血時被分泌出來。楊潼等使水蛭充分饑餓，采取一種特殊的技術從活體水蛭中提取唾液腺分泌物。黃仁槐等采取擠壓的方法獲取水蛭嗦囊內消化液。這些方式可以獲得活性很高的粗體液，但是處理較為繁瑣，效率很低。大多數研究均摘取水蛭頭部進行勻漿處理，用丙酮、 乙醇或水提取。劉欣[1]等采用乙醇提取的方法，進行水蛭素提取，以水蛭素體積活力為指標，優化乙醇提取的條件。劉洋等利用丙酮對醫用水蛭勻漿液進行提取水蛭素粗品[2]，張彬等采用鹽浸提法、丙酮浸提法、醇浸提法進行粗提，結果表明，丙酮提取具有更高的得率[3]。丙酮沉淀法必須嚴格控制溫度，否則很容易造成水蛭素失活。覃裕永[4]使用乙醇和丙酮分次提取，真空回收溶劑后合并濾液進行真空冷凍干燥，發明工藝簡單、成本低廉，收率較高、產品質量好、保存期長。目前研究水蛭素分離純化的方法很多，主要涉及到粗提純和精制兩個步驟。

2.1.1粗提

2.1.1.1 PH沉淀法：將水蛭素粗提液25 m L加入四倍體積即100mL 0.9%的Na Cl溶液稀釋，攪拌20min：用15%的三氯醋酸溶液調p H值至2.5，于66.7℃保溫30 min（適當攪拌）后，4℃5×103r/min離心15min，收集上清液；再用l mol/L NaOH調pH值至7.0，4℃ 5x103r/min離心10rain，上清液即為粗提液，分別測定蛋白質含量和水蛭素活性，同時計算蛋白質回收率、活性回收率、純化倍數和比活。得蛋白質回收率為45.58%，活性回收率為55.55%，純化倍數為1.22，比活為6.41 AT-U/rag，得到的水蛭素粗提液雖然比較澄清，但其純化倍數相對而言較低，原因可能是這種方法采用加入較大體積的Na Cl溶液，提供一個溫和的環境造成的溶液過稀，造成需要進一步的處理才能得到更好的濃度；

2.1.1.2有機溶劑沉淀法：取水蛭素唾液腺分泌物10 m L，用4倍體積即40 m L含水15%的冷丙酮溶液沉淀（含水15%的冷丙酮溶液預先配制好，放冰箱中預冷保存）用玻璃棒輕輕攪拌冷丙酮溶液和水蛭素唾液腺分泌物的混合物，存放在冰箱中過夜。將混合物在5x103 r/min下離心15min，濾去上清液部分，收集沉淀，然后用15%的20 m L三氯乙酸溶液溶解，再次在5x103r/rain下離心5 rain，去除不溶解的物質，收集上清液，分別測定蛋白質含量和水蛭素活性，同時計算蛋白質回收率、活性回收率、純化倍數和比活。得蛋白質回收率為18.70%，活性回收率為33.34%，純化倍數為1.78，比活為4.71AT-U/mg，通過添加丙酮來達到沉淀的目的，但是同時給測定活性造成的了很大的困難，要求低溫操作使操作過程容易引起目標蛋自失活；

2.1.2 精制

2.1.2.1離子交換層析法：用磷酸鹽緩沖液平衡離子交換層析柱，取10ml粗提液進樣，用起始緩沖液充分流洗，再以0—1.0 mol/L Na Cl梯度洗脫，收集速度為10 min/管， ，自動收集后，每隔3管（O.5 h）測定活性一次，根據所測的結果，收集活性峰，經透析濃縮后再測定活性峰的蛋白質含量和活性。

結果表明，利用DEAE SephadexA-50和DEAESepharoseCL-6B樹脂對水蛭素粗提液進行離子交換層析，經過DEAE Sephadex A一50柱層析得到的水蛭素比活性僅達到15.9AT-U/mg水蛭素，純化倍數不到3，同時回收率也不高；但是經過DEAE Sepharosc CL-6B柱層析所得到的水蛭素比活性能達到100AT-U/mg水蛭素以上，純化倍數也接近20，活性回收率較高。可知DEAE Sepharose CL-6B柱層析的分離效果和產物理想程度比DEAESephadexA-50柱層析要好。

2.1.2.2凝膠過濾層析法：經DEAE Sepharose CL-6B柱層析后的水蛭素溶液3mL上樣，經Sephadex G.25柱層析后，收集有效峰后，經濃縮再測定其蛋白質含量和活性。用此法進行脫鹽，效果最好，規律性較強，同時隨著洗脫速度的增加，所需的洗脫時間越來越短。用30 m L/h的流速進行脫鹽的效果最好，其收集液比活為1017AT-U/mg，蛋白質回收率為7.22%，活性回收率為63%，純化倍數為8.73。

參考文獻

[1] 劉欣， 張文清， 夏瑋，等. 提取水蛭有效成分初探[J]. 中成藥， 2002， 24（11）：894-895.

[2] 劉洋， 崔紅. 水蛭素的分離與純化[J]. 牡丹江醫學院學報， 2004， 25（2）：35-36.

[3] 張彬， 汪波， 龔元，等. 幾種水蛭抗凝血物質提取及活性分析[J]. 中山大學學報（自然科學版）， 2012， 51（4）：92-96.

[4] 覃裕永. 一種天然水蛭素有效成分的提取方法： CN， CN 101108879 A[P]. 2008.