如意珍寶片對骨關節炎性痛的抑制作用

陳海坤，柏虎虎，李宇哲，朱閱賓，葛安娜，吳樹金，劉燕妮，胡曉東

(蘭州大學藥學院分子藥理研究所，甘肅 蘭州 730000)

慢性疼痛是骨關節炎(osteoarthritis，OA)的主要癥狀，也是臨床治療面臨的棘手問題[1]。骨關節炎性痛(osteoarthritic pain)由組織損傷和神經病變共同引起，機械性痛覺超敏(mechanical allodynia)為其典型特征[2]，包括靜態痛覺超敏(static allodynia)和動態痛覺超敏(dynamic allodynia)。

實驗動物的OA模型按誘發方式，可分為自發性、手術誘導和非手術誘導三類[1]。內側半月板-脛骨韌帶切斷術(destabilization of the medial meniscus，DMM)是一種常用的手術誘導的骨關節炎模型，手術造成的小鼠膝關節不穩定會誘發軟骨組織和神經病變，導致慢性病理性疼痛的形成，并且痛覺超敏癥狀與關節病變的發展程度存在明顯的相關性[3-5]。

如意珍寶片是在藏藥如意珍寶丸的基礎上發展的一種新劑型，由珍珠母、沉香、石灰華等組成。如意珍寶片主要用于清熱醒腦、舒筋通絡、關節不利、治療白脈病等神經系統疾病。我們先前的研究發現，在脊髓背角中，NMDA受體(N-methyl-D-aspartate receptors)功能亢進參與病理性疼痛的發生、發展，GABAA能去抑制可增加NMDA受體GluN1亞基第897位絲氨酸磷酸化(pS897-GluN1)，提高GluN1亞基的突觸分布，導致痛覺敏化[6]。本文旨在探究如意珍寶片緩解骨關節炎性痛的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6小鼠(♂)，年齡8～12周，由蘭州大學實驗動物中心提供(動物合格證號：SCXK(甘) 2018-0002)。

1.2 主要材料如意珍寶片(甘肅奇正藏藥有限公司；批準文號：國藥準字Z20100061；生產批號：2003001)、多聚甲醛(Sigma-Aldrich，貨號：158127)、正常山羊血清(Jackson ImmunoResearch，貨號：138751)、山羊抗兔GluN1- pS897抗體(Millipore，貨號：06-641)、Cy3偶聯的山羊抗兔熒光二抗(Abcam，貨號：ab6939)、AMPA受體阻斷劑CNQX(Sigma-Aldrich，貨號：C127)、NMDA受體阻斷劑D-APV(Sigma-Aldrich，貨號：A8054)、甘氨酸受體阻斷劑strychnine (Sigma-Aldrich，貨號：S450162)、鈉通道阻斷劑TTX(Sigma-Aldrich，貨號：SML0378)、GABAA受體阻斷劑bicuculline (Sigma-Aldrich，貨號：B8398)、Von Frey纖維針(Stoehing，USA)、自制毛刷、BX51WIF熒光顯微鏡(Olympus，Japan)、Axon700B型膜片鉗放大器(Axon Instrument，America)、冷凍切片機(Leica，Germany)、體式顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)、FV1200型激光共聚焦顯微鏡(Olympus Corporation，Japan)、ZQP-86型振動切片機 (上海之信儀器有限公司)。

1.3 DMM模型在進行DMM手術之前，對小鼠進行痛覺篩選，連續3 d進行行為學測試，并剔除痛覺異常的小鼠(50%縮足反應閾值<1 g，毛刷誘發的痛行為評分>0.5)，對痛覺測試結果在正常范圍內的小鼠造模。小鼠用戊巴比妥鈉(90～120 mg·kg-1)腹腔注射麻醉。在體式顯微鏡下，無菌操作，行左側膝關節髕骨內側切口，暴露、并橫斷內側半月板-脛骨韌帶[3，7]。右側(假手術側)僅做皮膚切口。逐層縫合傷口。

1.4 灌胃給藥如意珍寶片研磨、粉碎，以每0.625、1.25、2.5 g·L-1比例溶解于蒸餾水。按照20 mL·kg-1的比例灌胃，即相當于每只小鼠給予如意珍寶片12.5、25、50 mg·kg-1，每天給藥1次，連續給藥6 d。

1.5 行為學測定

1.5.1靜態痛覺超敏 將小鼠放在底部為金屬鐵絲網的測試籠里，適應30 min，在造模前、后的不同時間點，使用不同力度的von Frey纖維，垂直刺激小鼠的后足底掌心皮膚，觀察小鼠的撤足和舔足反應，以up-down法[8-9]，按照下列公式，計算50%縮足反應閾值(paw withdrawal thresholds，PWT)：

50% PWT (g)=(10[Xf+K·δ])/10 000；Xf=最小von Frey力度值，K=常數，δ=0.26。

1.5.2動態痛覺超敏 將小鼠放在底部為金屬鐵絲網的測試籠里，適應30 min，在造模前、后的不同時間點，以特制的毛刷[10]，從足跟向足尖方向輕刷小鼠的足底皮膚，以下列標準判定動物的疼痛分值[11]：

0：移步或簡單的抬足；

1：持續抬足，時間超過2 s；

2：連續后足抖動；

3：舔足；

每只小鼠測試3次，每次間隔2 min，計算3次的平均值。

1.6 免疫組化染色小鼠用戊巴比妥鈉(90～120 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，左心室逆向灌注4 ℃的20 mL生理鹽水和10 mL的多聚甲醛，分離腰膨大部脊髓，用30%的蔗糖溶液4 ℃脫水過夜；冰凍切片機切取厚16 μm組織片；在包含0.25% Triton X-100和10%正常山羊血清的PBS中4 ℃封閉過夜；加入一抗，4 ℃過夜；加入二抗，在暗處室溫孵育2 h。封片。激光共聚焦顯微鏡拍片[8]。

1.7 電生理學記錄小鼠用戊巴比妥鈉(90～120 mg·kg-1)麻醉，脊髓轉入4 ℃、充氧(95% O2+5% CO2) 的蔗糖溶液(mmol：50.0 sucrose，95.0 NaCl，1.8 KCl，0.5 CaCl2，7.0 MgSO4，1.2 KH2PO4，26.0 NaHCO3，15.0 D-glucose，pH 7.4)，體式顯微鏡下，快速剝離脊膜，固定于瓊脂槽，橫向切取300 μm的脊髓片，轉入記錄槽，灌流(5 mL·min-1)充氧的ACSF至少1 h后，以BX51WIF熒光顯微鏡的40倍物鏡，挑選Ⅱ板層的健康細胞，在電壓鉗模式下(鉗制電壓0 mV)，以Axon700B型放大器記錄mIPSCs，充灌電極內液(mmol：110.0 Cs2SO4，5.0 KCl，2.0 MgCl2，0.5 CaCl2，5.0 HEPES，5.0 EGTA，5.0 Mg-ATP，0.5 Na-GTP，pH 7.2，295～300 mOsm)的電極電阻為3～8 MΩ，細胞外液中加入AMPA受體阻斷劑CNQX (10.0 μmol)、NMDA受體阻斷劑D-APV(50.0 μmol)、甘氨酸受體阻斷劑strychnine(2 μmol)和鈉通道阻斷劑TTX (0.5 μmol)。鉗制電壓在-70 mV，記錄mEPSCs，電極內液為(mmol)：115 CsMeSO4，20 CsCl，10 HEPES，2.5 MgCl2，4 Na-ATP，0.4 Na-GTP，0.6 EGTA，10 sodium phosphocreatine (pH 7.25，295-300 mOsm)，細胞外液中加入GABAA受體阻斷劑bicuculline(10 μmol)、strychnine (2 μmol)和TTX(0.5 μmol)。實時監測串聯阻抗和輸入阻抗的變化，任一阻抗的變化超過15%則細胞棄用。信號的過濾頻率2 kHz，采樣率為10 kHz[8]。

2 結果

2.1 如意珍寶片對DMM誘發的靜態痛覺超敏的影響我們在測定小鼠的基礎痛閾后，制備左側DMM模型，連續監測痛閾的變化。結果顯示：從造模后d 7開始，von Frey纖維誘發的左側縮足反應閾值(PWT)顯著下降(Fig 1A)，而右側(假手術側)的痛閾卻沒有明顯變化，在實驗期內始終維持穩定(Fig 1A)，說明DMM誘發出了靜態痛覺超敏。隨后，我們灌胃給予生理鹽水、如意珍寶片小劑量(12.5 g·kg-1，Fig 1B)、中劑量(25 mg·kg-1，Fig 1C)和大劑量(50 mg·kg-1，Fig 1D)，每天給藥1次，連續給藥6 d，發現：生理鹽水不會對靜態痛覺超敏產生明顯的影響(Fig 1A)。灌胃給予如意珍寶片，能夠劑量依賴性地升高左側PWT值(Fig 1B-1D)；在末次給藥后，各組動物的左側PWT值如Fig 1E所示，和DMM動物相比，25 mg·kg-1和50 mg·kg-1的如意珍寶片能夠顯著提高PWT值，有效緩解靜態痛覺超敏。

2.2 如意珍寶片對DMM誘發的動態痛覺超敏的影響相比于靜態痛覺超敏，動態痛覺超敏的臨床治療更為困難。DMM會誘發明顯的動態痛覺超敏(Fig 2A)，表現為非傷害性的輕微毛刷刺激也會引起小鼠的撤足、舔足等痛行為；這些痛反應在DMM后7 d即出現，而右側(假手術側)則不會對毛刷刺激產生明顯的反應(Fig 2A)。灌胃給予生理鹽水不會對痛行為的評分值產生任何影響(Fig 2A)。但灌胃給予如意珍寶片，能夠劑量依賴性地降低痛反應(Fig 2B-2D)；在末次給藥后，各組動物的左側痛行為評分如Fig 2E所示，和DMM動物相比，50 mg·kg-1的如意珍寶片能夠顯著降低痛行為評分，有效緩解動態痛覺超敏。

Fig 1 Effect of Ruyizhenbao tablets on static allodynia A:Changes of PWTs between DMM and sham groups after injection of saline.B:Changes of PWTs between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (12.5 mg·kg-1).C:Changes of PWTs between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (25 mg·kg-1).D:Changes of PWTs between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (50 mg·kg-1).E:Effects of different doses of Ruyizhenbao tablets on static alladynia in DMM mice.BL：The baseline of pain threshold.The arrows showed the time point of the corresponding treatment.*P<0.05 vs DMM group.

Fig 2 Effect of Ruyizhenbao tablets on dynamic allodynia A:Time-dependent changes of dynamic score between DMM and sham groups after injection of saline.B:Time-dependent changes of dynamic score between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (12.5 mg·kg-1).C:Time-dependent changes of dynamic score between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (25 mg·kg-1).D:Time-dependent changes of dynamic score between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (50 mg·kg-1).E:Effects of different doses of Ruyizhenbao tablets on dynamic score in DMM mice.BL：The baseline of pain threshold.The arrows showed the time point of the corresponding treatment.*P<0.05 vs sham group.

2.3 如意珍寶片對脊髓背角興奮性突觸傳遞的影響在DMM誘發小鼠痛覺超敏后4周，灌胃給予不同劑量的如意珍寶片，每天給藥1次，連續6 d；在末次給藥后0.5～1 h，切取離體脊髓片，記錄AMPA受體介導的微小興奮性突觸后電流 (mEPSCs)。結果顯示：DMM可顯著提高mEPSCs的頻率(Fig 3A)，和假手術對照組相比，差異具有顯著性(Fig 3B)；灌胃給予如意珍寶片(12.5 mg·kg-1，25 mg·kg-1和50 mg·kg-1)，能夠劑量依賴性的降低mEPSCs的頻率(Fig 3B)。然而，DMM后，mEPSCs的幅值沒有明顯的變化(Fig 3C)，和對照組相比，差異無顯著性；各劑量的如意珍寶片也不會對mEPSCs的幅值產生明顯影響(Fig 3C)，提示：如意珍寶片可能通過突觸前機制，阻滯痛覺信息的傳遞。

2.4 如意珍寶片對脊髓背角抑制性突觸傳遞的影響在DMM誘發小鼠痛覺超敏后4周，灌胃給予不同劑量的如意珍寶片，每天給藥1次，連續6 d；在末次給藥后0.5～1 h，切取離體脊髓片，記錄GABAA受體介導的微小抑制性突觸后電流(mIPSCs)。結果顯示：DMM可降低mIPSCs的頻率和幅值(Fig 4A)，和假手術對照組相比，差異具有顯著性(Fig 4B-4C)，提示：DMM誘發了脊髓去抑制。然而，灌胃給予如意珍寶片不會對mIPSCs的頻率和幅值產生明顯影響(Fig 4A)，和模型組動物相比較，差異無統計學意義(Fig 4B-4C)，提示：如意珍寶片不能逆轉DMM誘發的脊髓去抑制。

2.5 如意珍寶片對脊髓背角NMDA受體磷酸化的影響在DMM誘發小鼠痛覺超敏后4周，我們灌胃給予不同劑量的如意珍寶片，每天給藥1次，連續6 d；在末次給藥后0.5～1 h，在脊髓背角觀察NMDA受體pS897-GluN1的變化。結果顯示：和對照組相比，DMM小鼠的單位面積下pS897-GluN1的免疫反應強度明顯升高(Fig 5)，而如意珍寶片能夠劑量依賴性地降低pS897-GluN1水平(Fig 5)。

3 討論

在骨關節炎疼痛狀態下，關節軟骨退化嚴重，滑膜及半月板中的血管生成增加，刺激關節處感覺神經生長，多種炎性細胞因子的表達增加，導致關節處炎癥的發生。機械性痛覺超敏是骨關節炎患者的典型癥狀之一，嚴重影響患者的生活質量。本研究顯示，灌胃給予如意珍寶片能夠有效緩解DMM誘發的動態痛覺超敏和靜態痛覺超敏，提示如意珍寶片對骨關節炎性痛的良好的治療效果。

Fig 3 Effect of Ruyizhenbao tablets on frequency (A，B) and amplitude (A，C) of mEPSCs in spinal cord dorsal horn 1：Sham;2:DMM;3:Ruyizhenbao tablets/12.5 mg·kg-1；4:Ruyizhenbao tablets/25 mg·kg-1；5:Ruyizhenbao tablets/50 mg·kg-1.*P<0.05 vs sham group (Kruskal-Wallis test)，#P<0.05 vs DMM group (Kruskal-Wallis test).

Fig 4 Effect of Ruyizhenbao tablets on frequency (A，B) and amplitude (A，C) of mIPSCs in spinal cord dorsal 1：Sham;2:DMM;3:Ruyizhenbao tablets/12.5 mg·kg-1；4:Ruyizhenbao tablets/25 mg·kg-1；5:Ruyizhenbao tablets/50 mg·kg-1.*P<0.05 (Kruskal-Wallis test).

Fig 5 Effect of Ruyizhenbao tablets on pS897-GluN1 induced by n=8)1：Sham;2:DMM;3:DMM/Saline;4:DMM/12.5 mg·kg-1；5:DMM/25 mg·kg-1；6:DMM/50 mg·kg-1.*P<0.05 vs sham group，#P<0.05 vs DMM group.

外周炎癥及神經損傷之后，脊髓背角中興奮性谷氨酸能突觸傳遞的增強是誘發和維持慢性痛的重要機制。突觸前膜遞質的釋放增加、和/或突觸后膜谷氨酸受體的功能亢進，都有可能導致突觸傳遞的增強。mEPSCs的頻率和幅值變化，分別代表了突觸前膜和突觸后膜的功能改變。本研究發現DMM之后，mEPSCs的頻率明顯提高，但其幅值卻沒有明顯變化，提示DMM可能通過促進突觸前膜的遞質釋放，誘發骨關節炎性痛。我們的結果顯示，如意珍寶片能夠有效降低mEPSCs的頻率，而對其幅值沒有明顯作用，說明如意珍寶片可能作用于突觸前膜，抑制谷氨酸的釋放，減弱痛覺信息的傳遞，從而產生良好的鎮痛效果。

興奮性NMDA型谷氨酸受體的功能亢進是增強痛覺信息傳遞、提高脊髓背角痛覺傳遞神經元的興奮性、誘發和維持機械性痛覺超敏的重要原因。外周組織或神經損傷之后，脊髓背角NMDA受體的磷酸化水平會明顯升高[12]；磷酸化修飾是導致NMDA受體功能亢進的關鍵途徑[13]。通過免疫組化實驗，我們觀察了如意珍寶片對NMDA受體GluN1亞基的影響，發現如意珍寶片呈劑量依賴性地降低了GluN1亞基S897位的磷酸化。眾所周知，GluN1亞基的S897是cAMP依賴性蛋白激酶的磷酸化位點，我們先前研究發現，GluN1亞基的S897磷酸化水平降低能夠減輕炎癥疼痛[6]。S897磷酸化水平的降低提示：如意珍寶片可能通過對PKA的活性的抑制來緩解骨關節炎性痛。

我們先前研究表明，脊髓背角中抑制性突觸傳遞的減弱是誘發病理性疼痛的又一關鍵因素[6]。提高GABA能抑制效率，可產生明顯的鎮痛效果[14]。我們的研究顯示，DMM可降低mIPSCs的頻率和幅值，提示脊髓去抑制參與DMM誘發的骨關節炎性痛。然而，各種劑量的如意珍寶片都不會對抑制性突觸傳遞產生明顯的影響。因此，我們的研究結果提示，如意珍寶片可能特異性干預興奮性突觸傳遞，有效緩解骨關節炎性痛。如意珍寶片含有多種成分，其靶向興奮性突觸傳遞的具體成分和特異性干預興奮性突觸傳遞的分子機制都不夠明確，除此之外，我們尚未檢測骨關節炎引起的關節滑液中炎性因子的變化情況，這些問題需要我們進一步的深入研究。

(致謝：本實驗在蘭州大學藥學院分子藥理學研究所完成，對本實驗提供技術支持和實驗幫助的老師同學表示感謝。)