小麥EMS突變體的創(chuàng)制與性狀鑒定

袁秀芳 王丹峰 殷慧娟 何方 劉樹兵

摘要：EMS（甲基磺酸乙酯）誘變育種技術(shù)是利用EMS處理種子，使其發(fā)生基因突變，在短期內(nèi)獲得有價(jià)值的突變體，為育種工作提供豐富遺傳變異的一項(xiàng)技術(shù)。本研究利用EMS誘變處理小麥品系山農(nóng)666-2和山農(nóng)861的種子，在M1代分別收獲203、306個(gè)單株，種成M2株行；在M2代，每一行收獲一個(gè)代表性單株，同時(shí)收獲有明顯變異的單株，最終，山農(nóng)666-2及山農(nóng)861各收獲290、412個(gè)單株，種成M3株系。對(duì)M3代進(jìn)行了株高、抽穗期、白粉病、條銹病等性狀的調(diào)查分析。在山農(nóng)666-2中，株高變異明顯，變異范圍為40～80 cm，獲得一些高稈、矮稈變異株系；鑒定出一些高抗條銹病或高感白粉病的株系；發(fā)現(xiàn)較野生型最早提前2天或最晚延遲14天抽穗的株系。在山農(nóng)861中，同樣獲得高稈、矮稈變異株系，株高變異范圍在25～85 cm；鑒定出一些高抗白粉病或高感條銹病的株系；抽穗期變異從最早提前3天抽穗至延后11天抽穗。本次誘變處理獲得的突變體變異豐富，這為小麥農(nóng)藝性狀相關(guān)基因及抗病基因的發(fā)掘、克隆及功能研究提供了重要的基礎(chǔ)材料，同時(shí)也為小麥育種提供了重要的種質(zhì)來源。

關(guān)鍵詞：小麥；EMS誘變；突變體；農(nóng)藝性狀；抗病性

中圖分類號(hào)：S512.103.52文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）07-0061-06

Abstract EMS （ethyl methane sulfonate） mutagenesis is a technology that uses EMS to treat seeds and cause mutations， so that we can obtain valuable mutants in a short period and provide a large number of germplasm resources for breeding. In this study， the seeds of wheat cultivars Shannong 666-2 and Shannong 861 were treated respectively by EMS， and we obtained 203 Shannong 666-2 and 306 Shannong 861 single plants in the M1 generation， then planted them into M2 lines. In M2 generation， one representative plant in each row and the single plants with significant variation were harvested. We obtained 290 Shannong 666-2 and 412 Shannong 861 single plants， and then planted as M3 lines. In the M3 generation， the traits such as plant height， heading date， resistance to powdery mildew and stripe rust were investigated in the adult plant stage. In Shannong 666-2， the variation of plant height was obvious with the variation range of 40～80 cm， and several high and dwarf mutant lines were obtained； some strains with high resistance to stripe rust or highly susceptible to powdery mildew were identified. It was found that the heading date of some lines was 2 days earlier or 14 days later than the wild type. In Shannong 861， we also obtained several high or dwarf mutant lines， and the plant height range was 25～85 cm； some strains with high resistance to powdery mildew or high sensitivity to stripe rust were identified. And the change in heading date ranged from 3 days earlier or 11 days later than the wild type. The above results indicated that the mutants obtained by this mutagenesis was abundant， which provides important basic materials for the identification， cloning and functional analysis of wheat agronomic trait-related genes and disease-resistant genes， as well as important germplasm for wheat breeding.

Keywords Wheat； EMS mutagenesis； Mutant； Agronomic traits； Disease resistance

小麥?zhǔn)鞘澜缛蠹Z食作物之一，世界上超過三分之一的人口以小麥為主糧。在我國，小麥?zhǔn)潜狈饺丝诘闹饕臣Z，每年種植面積約2 300萬公頃，占全國糧食消費(fèi)總額的1/5以上，居第三位，僅次于水稻和玉米[1]。近年來，隨著我國人口快速增長，城市化進(jìn)程加快，土地種植面積減少，供求矛盾日益突出，怎樣快速提高小麥產(chǎn)量和質(zhì)量，是目前亟待解決的問題之一。

影響小麥產(chǎn)量的因素很多，如株高、抽穗期、抗病性等。株高通過影響開花期、植株倒伏程度來影響小麥產(chǎn)量[1]；抽穗期是小麥長期適應(yīng)不同地區(qū)和氣候環(huán)境條件的重要體現(xiàn)，它不僅與生育期密切相關(guān)，而且直接影響產(chǎn)量、抗病、抗逆等許多重要農(nóng)藝性狀[2]；另外，近年來以白粉病、銹病為代表的多種小麥病害[3]也嚴(yán)重影響著小麥的產(chǎn)量，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致絕收。培育高產(chǎn)抗病、抗倒伏的小麥品種是解決這些問題最有效的途徑，而EMS誘變技術(shù)是幫助育種家獲得有益變異的有效手段之一。

甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfone，EMS）是一種可以改變DNA結(jié)構(gòu)的烷化劑。利用EMS處理種子以構(gòu)建突變體庫是獲得優(yōu)異種質(zhì)資源的重要途徑，具有種質(zhì)創(chuàng)新頻率高、遺傳變異譜寬、育種周期短等優(yōu)點(diǎn)。此外，以EMS突變體為基礎(chǔ)，可以快速篩選目的基因突變個(gè)體，挖掘新基因，開展功能基因研究[4]。由于EMS誘變技術(shù)在突變過程中容易形成點(diǎn)突變且不會(huì)造成染色體畸變，因而被廣泛用于構(gòu)建突變體庫。如：Kuraparthy等[5]利用栽培一粒小麥（T. monococcum）構(gòu)建EMS突變體庫，篩選到提高小麥有效分蘗的突變株，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了控制分蘗的tin3基因；陳洋等[6]用EMS處理抗黃矮病的小麥-中間偃麥草易位系YW642的種子，從M2中篩選出32種不同性狀的突變體；沈銀柱等[7]利用EMS誘發(fā)小麥花藥愈傷組織獲得耐鹽再生植株，并以鹽脅迫為選擇壓力，篩選出一級(jí)耐鹽品系。除此之外，還成功構(gòu)建了偃展4110[8]、豫農(nóng)201[9]、京411[10]等表型變異豐富的突變體庫，獲得了一些性狀優(yōu)良的突變體，為小麥遺傳育種和基因克隆提供了材料來源。

為了構(gòu)建新的突變體庫，進(jìn)一步豐富小麥遺傳育種和功能基因組學(xué)的基礎(chǔ)材料，本研究利用EMS誘變技術(shù)處理兩個(gè)小麥高產(chǎn)品系山農(nóng)861及山農(nóng)666-2的種子，并進(jìn)行相關(guān)農(nóng)藝性狀、抗病性等表型的考察，旨在為小麥新品種選育和基因克隆提供有價(jià)值的種質(zhì)材料，為發(fā)掘、鑒定有關(guān)農(nóng)藝性狀和抗病性相關(guān)基因及其功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山農(nóng)666-2與山農(nóng)861均為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的小麥新品系，由王洪剛教授提供。這兩個(gè)材料的共同特點(diǎn)是穗大、抗倒伏，同時(shí)具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。不同之處在于：山農(nóng)666-2高抗白粉病，但高感條銹??；山農(nóng)861高抗條銹病，但高感白粉病。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 EMS誘變處理 在室溫下分別用0.30%、0.35%、0.40%和0.45%的EMS各處理500粒山農(nóng)666-2的種子，置于培養(yǎng)皿中發(fā)芽7天，統(tǒng)計(jì)各濃度下的發(fā)芽率和存活率，以確定最適的EMS處理濃度；用0.35%、0.40%的EMS處理山農(nóng)861，存活率分別為64.3%、39.2%。以50%的存活率為衡量標(biāo)準(zhǔn)，最終確定山農(nóng)666-2、山農(nóng)861的最適EMS處理濃度分別為0.40%、0.38%。兩個(gè)品系分別處理3 500粒種子，處理方法參見Slade等（2005）[11]的方法。

1.2.2 田間種植、管理與收獲 處理過的種子置于培養(yǎng)皿發(fā)芽后，于2014年11月種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)站，種植密度為行長1.5 m，行距0.25 m，株距0.10 m。2015年成熟時(shí)收獲所有存活單株的種子，其中，山農(nóng)666-2收獲203個(gè)單株，山農(nóng)861收獲306個(gè)單株。2015年秋季播種時(shí)，每個(gè)單株取10～20粒種子，種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)站，每個(gè)單株種一行，構(gòu)建成203個(gè)山農(nóng)666-2 M2株行及306個(gè)山農(nóng)861 M2株行。記載材料生長過程中幼苗、葉、莖、穗部等的表型變化，并調(diào)查株高、抽穗期、白粉病及條銹病抗性等性狀。鑒于M2代同一個(gè)株行的不同單株間仍可能存在變異，故收獲時(shí)，沒有出現(xiàn)明顯分離的株系，僅收獲一個(gè)單株；出現(xiàn)明顯分離的株系，先收獲一個(gè)最具代表性的單株作為該株系的代表菌株，再收獲具有明顯變異的單株。山農(nóng)666-2共收獲290個(gè)單株，山農(nóng)861共收獲412個(gè)單株。這些單株于2016年秋播時(shí)每株取20粒種子，種植在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)站，每個(gè)單株種一行，并對(duì)其株高、抽穗期、白粉病及條銹病抗性等性狀進(jìn)行調(diào)查分析。在M2、M3代種植過程中，每隔20行種植野生型及高感白粉病和條銹病的銘賢169材料各一行作為對(duì)照行及感染行，澆水、施肥等管理同正常田間管理。

1.2.3 抽穗期與株高調(diào)查方法 在調(diào)查抽穗期時(shí)，當(dāng)每一株行中有三分之一的植株已抽穗，且每個(gè)穗子抽出三分之二時(shí)，確定為該株行的抽穗日期，抽穗期即為播種日期至抽穗日期間的天數(shù)。

株高為從基部至主莖頂部即主莖生長點(diǎn)之間的距離。

1.2.4 病害鑒定 白粉病鑒定：由于試驗(yàn)地每年白粉病發(fā)病都很嚴(yán)重，白粉病抗性鑒定采用自然發(fā)病法。每隔20行種植高感白粉病、條銹病材料銘賢169作為感染行，當(dāng)其成株期白粉病發(fā)病達(dá)到4級(jí)后，調(diào)查白粉病抗性，白粉病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照盛寶欽等[12]提出的6級(jí)反應(yīng)級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

條銹病鑒定：采用人工接種鑒定法，按照高盛國等[13]提出的注射接種方法，利用CYR31、CYR32混合菌種進(jìn)行人工接種鑒定?？共〉燃?jí)劃分采用李振岐等[14]提出的6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表2）。

2 結(jié)果與分析

對(duì)EMS誘變處理后獲得的山農(nóng)666-2、山農(nóng)861 M2代株行進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，M2代出現(xiàn)了多種性狀變異，如葉片畸形、穗子畸形、植株矮化、分蘗數(shù)變化、抗病性變化、育性降低甚至不育等。進(jìn)一步對(duì)M3代290個(gè)山農(nóng)666-2、412個(gè)山農(nóng)861株系的株高、抽穗期、白粉病及條銹病抗性等進(jìn)行調(diào)查分析，結(jié)果如下。

2.1 株高

山農(nóng)666-2株高約70 cm，經(jīng)EMS誘變后，M3株系的株高出現(xiàn)2種類型的明顯變異（圖1、圖2a）：一是矮稈突變，株高在65 cm以下的株系共87個(gè)，占M3株系總數(shù)的30%，平均株高為56 cm，最低株高僅為40 cm；二是高稈突變，株高在75 cm以上的視為高稈變異，共47個(gè)株系，占M3株系總數(shù)的16.2%，平均株高為78 cm，最高可達(dá)80 cm。

山農(nóng)861株高約68 cm，經(jīng)EMS誘變后，株高也發(fā)生了明顯的變異（圖1），其中株高在63 cm以下的矮稈變異共73個(gè)，占M3株系總數(shù)的17.7%，平均株高為56 cm，最矮至25 cm；株高在73 cm以上的高稈變異共有89個(gè)，占M3株系總數(shù)的21.6%，平均株高為78 cm，最高可達(dá)85 cm。

2.2 抽穗期

山農(nóng)666-2的抽穗期是198天，經(jīng)EMS誘變后，抽穗期有較大變異（圖1）。在290個(gè)M3代株系中，有3個(gè)抽穗期提前，占比1.0%，其中，有2個(gè)株系的抽穗期提前2天，1個(gè)株系提前1天；抽穗期延遲的株系較多，共205個(gè)，占比70.7%，最晚的延遲14天。

山農(nóng)861的抽穗期是199天，經(jīng)EMS誘變后獲得了不同抽穗期的突變株系（圖1）。其中，70個(gè)株系的抽穗期提前1～3天，占比16.9%；287個(gè)株系的抽穗期延遲，占比69.7%，最晚的延遲11天。

2.3 白粉病抗性

經(jīng)EMS誘變后，山農(nóng)666-2白粉病抗性發(fā)生3種類型變異（圖1）：①59個(gè)株系由高抗突變?yōu)橹锌?，占?0.3%；②23個(gè)株系由高抗突變?yōu)橹懈?，占?.9%；③7個(gè)株系由高抗突變?yōu)楦吒?，占?.4%。

山農(nóng)861經(jīng)EMS誘變后，也發(fā)生了3種類型白粉病抗性變異（圖1）：①127個(gè)株系由高感突變?yōu)橹懈校急?0.8%；②40個(gè)株系由高感突變?yōu)橹锌?，占?.7%；③78個(gè)株系由高感突變?yōu)楦呖挂陨希▓D2b），占比18.9%。

2.4 條銹病抗性

經(jīng)EMS誘變后，山農(nóng)666-2條銹病抗性發(fā)生3種類型變異（圖1）：①61個(gè)株系由高感突變?yōu)橹懈?，占?1.0%；②51個(gè)株系由高感突變?yōu)橹锌梗急?7.6%；③41個(gè)株系由高感突變?yōu)楦呖挂陨希▓D2c），占比14.1%。

山農(nóng)861經(jīng)EMS誘變后，同樣出現(xiàn)了3種類型條銹病抗性變異（圖1）：①30個(gè)株系由高抗突變?yōu)橹锌梗急?.3%；②6個(gè)株系由高抗突變?yōu)橹懈?，占?.5%；③3個(gè)株系由高抗突變?yōu)楦吒校▓D2d），占比0.7%。

2.5 白粉病、條銹病抗性均發(fā)生變異的突變

在白粉病和條銹病抗性變異株系中，有些兩者同時(shí)發(fā)生了變異，山農(nóng)666-2中有4個(gè)株系白粉病突變?yōu)楦吒卸鴹l銹病突變?yōu)楦呖梗急?.4%；山農(nóng)861中有1個(gè)株系白粉病突變?yōu)楦呖苟鴹l銹病突變?yōu)楦吒?，占?.2%。

3 討論與結(jié)論

EMS濃度是影響突變體出芽率及變異頻率的一個(gè)重要因素。趙天祥等[15]分別用0.7%和1.2%的EMS處理小麥品種偃展4110，表型變異率分別為2.9%與3.7%。本研究首先分別利用四種濃度（0.30%、0.35%、0.40%、0.45%）和兩種濃度（0.35%、0.40%）的EMS預(yù)處理小麥品系山農(nóng)666-2和山農(nóng)861的種子，通過比較各濃度下的發(fā)芽率和存活率，確定適合兩品種的最適EMS處理濃度分別為0.40%和0.38%，再用最適濃度的EMS處理小麥種子，從而提高了變異頻率。但本研究確定的EMS最適濃度與前人的差異較大，可能是因?yàn)镋MS濃度對(duì)基因型不同的材料影響不同。

經(jīng)EMS誘變處理后的小麥種子，農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀會(huì)發(fā)生不同類型的變異，且多為不良突變，優(yōu)良變異較少。本研究獲得了一些有益突變，為了降低突變不穩(wěn)定性，對(duì)M3代突變株系的株高、抽穗期及部分抗病性進(jìn)行調(diào)查，最終獲得了多種突變株系。其中，突變株系的最大株高差可達(dá)60 cm，因此，對(duì)株高差異較大的突變株配制雜交組合，培育大的分離群體，可以加快株高相關(guān)基因的定位與克隆?？刂菩←湷樗肫诘幕蛴腥悺夯颉⒐庵芷诨蚣捌渌?，這些基因中的任何一個(gè)或幾個(gè)發(fā)生突變都會(huì)造成晚熟，這也解釋了為什么本研究中抽穗期延后的突變株系遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于抽穗期提前的，下一步我們可以對(duì)抽穗期相差較大的單株進(jìn)行基因鑒定，尋找控制抽穗期的基因并運(yùn)用于小麥新品種的培育。

白粉病、條銹病等病害嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，選育抗病種質(zhì)是解決這一問題的有效手段。本研究利用EMS誘變，獲得了高抗條銹病及高感白粉病的山農(nóng)666-2突變株系和高抗白粉病及高感條銹病的山農(nóng)861突變株系，為小麥抗病基因定位及抗病品種選育提供了材料。

EMS誘變技術(shù)不需要進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，極易形成點(diǎn)突變且不對(duì)染色體造成影響，因而被廣泛用于構(gòu)建變異豐富的突變體庫，用于功能基因組學(xué)研究中。目前，已經(jīng)成功構(gòu)建了擬南芥[16]、玉米[17]、水稻[18]、番茄[19]、大麥[20]等多種植物的多個(gè)突變體庫，但小麥中構(gòu)建成功的突變體庫還較少。本研究成功構(gòu)建了兩個(gè)小麥品種的突變體庫，不僅有助于豐富小麥突變體庫，而且為株高、抽穗期、白粉病及條銹病抗性等性狀的改良提供了種質(zhì)材料。

參 考 文 獻(xiàn)：

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