黃連素對冠心病大鼠血管內皮細胞損傷的保護機制研究

曹雪明，朱娜

(河南省人民醫院，河南 鄭州 450000)

冠心病(coronary heart disease，CHD)是嚴重危害人類健康的疾病，近年來，CHD的發病趨勢逐年上升，且發病率趨于年輕化[1]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病發生的主要病理基礎，是一種復雜的慢性炎癥性病變，病理狀態下，動脈內皮細胞功能障礙會促進AS發展[2]。黃連素(berberine，BBR)是從黃連、黃柏等植物中提取的生物堿，具有一定的抗菌和降血脂作用，同時研究發現其可抑制平滑肌細胞增殖、改善血管內皮功能[3]。但BBR在冠心病引起的血管內皮損傷中的作用還未有報道，本研究通過建立冠心病大鼠模型，觀察BBR對模型動物血管內皮細胞的作用，探討其在上述作用中的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SD雄性大鼠50只，體質量(200±20)g，常州卡文斯實驗動物有限公司，動物質量合格證號：No.201722172。

1.1.2 試劑

BBR(國藥集團化學試劑有限公司);腦垂體后葉素(南京新百藥業有限公司)；ELISA即用型試劑盒(美國R& D system公司);RNAiso plus試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit 、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)引物(大連TaKaRa公司)。天冬氨酸水解酶 3剪切體(Cleaved-caspase 3)、B淋巴細胞瘤-2 (Bcl-2) 、Bcl -2相關x蛋白(Bax)和核因子-κB抑制蛋白(IκB)、核因子-κB亞基p65抗體及羊抗兔IgG-HRP二抗(美國CST公司);GAPDH 抗體(Bioworld公司);RIPA裂解液、BCA試劑盒(碧云天生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組

參考文獻[2]方法建立冠心病大鼠模型,每天給予高脂食物連續喂養6周；間隔24 h腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，連續3次。將模型動物分為實驗組和對照組，實驗組大鼠30只，對照組10只，實驗組予以高:100 mg/(kg·d)、中:50 mg/(kg·d)、低:25 mg/(kg·d)劑量BBR灌胃，每劑量組10只大鼠；對照組每天予以等BBR體積的雙蒸水灌胃。本實驗同時以正常SD大鼠10只設立空白組，予以等BBR體積的雙蒸水灌胃，實驗動物治療周期為12周。

1.2.2 酶聯免疫吸附法和硝酸酶還原法檢測血清中各指標含量

參考文獻[4]并根據說明書進行實驗操作，檢測大鼠血清中血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)含量變化。

1.2.3 RT-qPCR法檢測VEC中iNOS含量

收集各組模型大鼠的血管內皮組織，部分用來RT-qPCR檢測。按文獻[5]方法進行RNA提取和純化，RT反應，qPCR反應并計算分析實驗結果。

1.2.4 免疫印跡法分析各組大鼠相對蛋白表達量

收集各組模型大鼠的血管內皮組織，部分用來實驗。參考文獻[6]的方法進行蛋白提取、SDS-PAGE電泳、轉膜，及封閉。按需求加入Caspase 3抗體(1∶ 1 000)、Bcl-2抗體(1∶ 2 000)、Bax抗體(1∶ 2 000)、IκB抗體(1∶ 1 000)、p-IκB抗體(1∶ 1 000)、p65抗體(1∶ 1 000)、p-p65抗體(1∶ 500) 4℃溫育過夜。次日，TBST洗膜3次，再加入相應的辣根過氧化物酶標記二抗GAPDH(內參,1∶ 2 000)，室溫雜交1 h，PVDF膜以化學發光試劑盒進行顯色，用Syngene Imaging System進行成像，用Image J對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

2 結果

2.1 BBR對血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 、NO含量的影響

酶聯免疫吸附法和硝酸酶還原法檢測各指標發現，與空白組相比，對照組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著上升，NO含量下降，差異具有統計學意義(P<0.01)；與對照組相比，3種劑量的實驗組中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均有不同程度下降，NO上升，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 BBR治療前后冠心病大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 、NO含量變化

注：與空白組相比，#P<0.05；與對照組相比，*P<0.05

2.2 BBR下調VEC中iNOS含量

RT-qPCR檢測VEC中iNOS mRNA相對表達量發現，與空白組相比，對照組iNOS mRNA相對表達量明顯下降，差異具有統計學意義；與對照組相比，3種劑量的實驗組中iNOS mRNA相對表達量均出現上升，差異具有統計學意義。見圖1。

注：*P<0.05，**P<0.01圖1 各組模型動物iNOS mRNA相對表達量

2.3 BBR對模型鼠VEC中 Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax表達的影響

蛋白印記實驗發現在VEC中，與空白組相比，對照組Cleaved-caspase 3和Bax表達顯著上調，Bcl-2下調，差異具有統計學意義；與對照組相比，3種劑量的實驗組中Cleaved-caspase 3和Bax出現下調，Bcl-2顯著上調，差異具有統計學意義。見圖2，表2。

圖2 BBR對模型鼠VEC中 Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax表達的影響

表2 Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax相對蛋白表達量

注：與空白組相比，#P<0.05；與對照組相比，*P<0.05

2.4 BBR下調模型鼠VEC中IκB、 p65磷酸化水平

蛋白印記實驗發現VEC中，與空白組相比，對照組p-IκB和p-p65表達顯著上調，差異具有統計學意義；與對照組相比，3種劑量的實驗組中p-IκB和p-p65均明顯下調，差異具有統計學意義。見圖3，表3。

圖3 BBR對模型鼠VEC中IκB、 p65磷酸化水平的影響

表3 p-IκB和p-p65相對蛋白表達量

注：與空白組相比，#P<0.05；與對照組相比，*P<0.05

3 討論

CHD擁有復雜的病理機制，其中VEC損傷導致的功能障礙在CHD中起到了重要作用[2]。臨床研究表明，CHD患者血清NO含量明顯降低，而促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6出現上升[7-8]。本研究發現模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6顯著上升，NO含量下降且通過催化精氨酸合成NO的VEC中iNOS mRNA下調，這與臨床研究相一致。進一步實驗發現，三種劑量的BBR治療模型大鼠12周后，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6均降低，血清NO及VEC中iNOS mRNA上升，提示BBR可調節大鼠模型VEC功能并減緩炎癥反應。文獻報道，VEC凋亡在CHD的發病過程中起到了重要作用[9]。本實驗通過蛋白印記實驗檢測模型大鼠VEC中Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax表達發現VEC出現過度凋亡，而經三種劑量的BBR治療后，上述凋亡得到明顯緩解。

細胞核因子κB(NF-κB)為廣泛存在于細胞中的蛋白質分子，參與調節炎性因子和趨化因子在內的多種生物學信號，其活性受到IκB的抑制，NF-κB在IκB發生磷酸化并被蛋白酶體降解后被激活，從而使其活性亞單位P65進入細胞核，p65發生磷酸化進而發揮調節作用[10-11]。為探討BBR上述治療的作用機制，本研究觀察了NF-κB通路在其中的作用。結果顯示，CHD大鼠p-IκB和p-p65相對蛋白表達量明顯升高，而經三種劑量的BBR治療后p-IκB和p-p65相對蛋白表達量下降，NF-κB活性降低。提示，冠心病大鼠VEC中NF-κB信號通路處于激活狀態，而BBR可下調NF-κB活性。已有文獻報道NF-κB,參與調節VEC功能[12-13]，但本研究首次發現BBR通過NF-κB調節CHD大鼠VEC功能。目前，在BBR對CHD的作用機制方面的研究還未明了，有待于我們進一步研究。

綜上所述，BBR可能通過降低CHD大鼠VEC中NF-κB的活性，下調血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量，增加NO水平，從而發揮對冠心病大鼠VEC損傷的保護作用。