檳榔堿不同配伍環境下在肝微粒體中的代謝研究

王豪，張久旭，李夢薇，韓星，溫浩然，冀艷華，劉洋

(北京中醫藥大學，北京 100029)

檳榔為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子。味苦、辛，性溫，具有殺蟲，行氣，利水，消積，截瘧的作用。2003年，世界衛生組織把檳榔列入一級致癌物名錄。研究表明檳榔具有增加肝硬化和肝細胞癌的風險，對人和動物具有生殖系統毒性[1]。并有研究認為檳榔的毒性主要是由檳榔堿產生[2-3]。另有報道指出檳榔在正常劑量下使用，可能會出現中毒反應，如腹痛、嘔吐、流涎、呼吸急促等癥狀[4]。檳榔中的主要化學成分為生物堿、脂肪酸和鞣質，其中以檳榔堿含量最高。但是，檳榔水煎液中去甲檳榔次堿含量最高，這是否影響檳榔的藥效或者毒副作用，有待進一步研究。四磨湯源于宋代醫家嚴用的《嚴氏濟生方》，全方由檳榔、烏藥、枳殼、木香組成，可順氣降逆、消積止痛，在臨床使用中具有良好的治療效果，未見有相關毒副作用的研究。

中藥配伍減毒增效的作用機制一直是中藥研究中的一個重要方向，肝臟作為機體解毒的重要器官，也常作為研究藥物毒性作用機制的器官?；跈壚茐A或檳榔水煎液的毒性和四磨湯的無毒性，本文采用體外肝微粒溫孵的方法，清晰明了的刻畫出檳榔堿在不同配伍環境下的代謝變化情況。此外，由于檳榔水煎液中去甲檳榔次堿含量最高，去甲檳榔堿和檳榔次堿含量與檳榔堿接近，并且化學結構相似，因此，我們懷疑檳榔水煎液的毒性是否與此有關。在研究和分析檢測中我們加入了這三種生物堿，以觀察它們的代謝行為及對檳榔堿代謝行為的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器

WATERS 600液相色譜系統(Milford，MA，USA)，由 Delta 600四元泵和2487雙波長紫外檢測器組成，工作站為 Millennium 32；恒溫水浴鍋( HH-6，金壇市朗博儀器制造有限公司)；高速冷凍離心機(GL-21M，上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；電子分析天平(BT-25S，北京賽多利斯儀器有限公司)；酶標儀(SpectraMax L，美谷分子儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

檳榔(北京仟草中藥飲片有限公司提供，產地廣東)，四磨湯口服液(湖南漢森制藥股份有限公司生產)。氫溴酸檳榔堿購于中國藥品生物制品檢定所，鹽酸檳榔次堿購于阿法埃莎(中國)化學有限公司，氫溴酸去甲檳榔堿購于成都思天德生物科技有限公司，鹽酸去甲檳榔次堿購于Bio-Techne中國分公司。非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、氧化型輔酶Ⅱ、D-葡萄糖-6-磷酸二鈉(G-6-P)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)均購于北京拜爾迪生物科技有限公司；奧美拉唑購于北京伊諾凱科技有限公司；睪酮購于北京伊諾凱科技有限公司；SD雄性大鼠肝微粒體購于北京拜爾迪生物技術有限公司。

1.3 藥物制備

取檳榔飲片100 g，置具有冷凝回流裝置的圓底燒瓶中，加1 000 mL水，浸泡1 h后回流提取1 h，趁熱過濾出提取液。濾液經過旋轉蒸發濃縮，制成含生藥約0.5 g/mL的溶液，備用。

1.4 對照品溶液配制

精密稱取氫溴酸檳榔堿7.65 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用10%甲醇水定容至刻度，得0.503 mg/mL的對照品溶液，備用。同法，分別稱取鹽酸檳榔次堿6.30 mg、氫溴酸去甲檳榔堿6.25 mg、鹽酸去甲檳榔次堿6.46 mg，得到濃度分別為0.501 mg/mL、0.500 mg/mL、0.502 mg/mL的標準溶液，備用。

1.5 溫孵體系

精密取探針混合底物50 μL(濃度分別為非那西丁200 μmol/L、氯唑沙宗400 μmol/L、甲苯磺丁脲400 μmol/L、奧美拉唑200 μmol/L、睪酮400 μmol/L)或50 μL檳榔水煎液(濃度為0.5 mg/mL)或50 μL四磨湯溶液或50 μL檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿和去甲檳榔次堿溶液，濃度均為200 μg/L，于離心管中，氮氣吹干后，加入50 μL含有100 mM Tris-HCl 緩沖液，震蕩使底物溶解后，加入50 μL濃度約為2 mg/mL大鼠肝微粒體蛋白，于37℃水浴中溫孵5 min，加入100 μL NADPH 再生系統(含有2 mmol/L NADPNa2，20 mM G-6-P，4 U/mL G-6-PDH，20 mmol/L MgCl2)，水浴中反應30 min，取出，立即加入200 μL冰冷的乙腈終止反應，4℃ 15 000 g離心10 min，取上清液進行液相分析[5]。

1.6 分析方法

色譜柱為Ultimate XB-SCX(5 μm，4.6 mm×250 mm)。柱溫箱溫度為35℃；檢測波長為215 nm，280 nm。分析時采用流速1 mL/min的梯度洗脫系統：A(0.2%磷酸，濃氨水調pH 3.8水溶液)-B(80%乙腈)(50∶ 50)洗脫時間為15 min。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性

在“1.6”色譜條件下測得空白孵育體系、空白孵育體系加入對照品的譜圖見圖1，在本實驗條件下，內標有檳榔次堿、去甲檳榔次堿、檳榔堿和去甲檳榔堿，保留時間分別為9.416、11.603、20.275、22.604 min，結果表明該體系中內源性物質和其他代謝產物均不干擾待測物及內標的測定。

注：A.空白溫孵體系;B.空白孵育體系加入對照品圖1 專屬性實驗色譜圖

2.1.2 標準曲線

將“1.4”中的儲備液依次稀釋至100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/L濃度的溶液，進樣分析，測定其峰面積，求得檳榔次堿、去甲檳榔次堿、檳榔堿和去甲檳榔堿的標準曲線方程分別為Y=0.000 088X-10.046 821(r=0.999 1)、Y=0.000 084X-1.326 063(r=0.996 7)、Y=0.000 072X-3.614 874(r=0.999 3)、Y=0.000 096X-8.577 336(r=0.998 9)，表明四種生物堿在3.125～100 μg/L濃度范圍內均呈現良好的線性。

2.1.3 回收率和精密度

分別配制檳榔堿(Arecoline)、檳榔次堿(Arecaidine)、去甲檳榔堿(Guvacoline)、去甲檳榔次堿(Guvacine)四種生物堿 100、10、4 μg/L濃度的標準溶液各 3 份，進樣分析，記錄峰面積。配制上述相同濃度的孵育體系溶液，按照“1.5”項下依法操作，不同點在于加入微粒體后立即加入冰冷的乙腈終止反應，制備3份樣品，進樣分析，記錄峰面積，考察回收率。同日和連續 3 天各處理 3 份樣品，計算日內RSD和日間RSD，結果見表1。

表1 肝微粒體酶孵育體系中檳榔四種生物堿的精密度及回收率

2.1.4 穩定性

分別配制檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿四種生物堿100、10、4 μg/L濃度的酶孵育樣品溶液各5份，按“1.5”方法進行樣品處理后，分別在0和4 h進行測定，四種生物堿的RSD值均小于5%。樣品在-20℃條件下凍融3次，四種生物堿的RSD值均小于7%。

2.2 檳榔四種生物堿在肝微粒體中代謝前后的含量變化

由于檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿和去甲檳榔次堿的結構非常相似，并且依次去掉一個氮甲基或羧甲基，所以，我們認為檳榔堿在代謝過程中很有可能生成另外三種生物堿，因此，在檢測指標中加入了另外三種生物堿。比較各組代謝產物中檳榔生物堿的含量,按照公式1的方式進行計算，數據匯總見表2。

表2 檳榔生物堿體外溫孵實驗結果(n=3)

注：(+)表示酶有活性；(-)表示酶沒有活性

實驗組變化率=(對照組含量-實驗組含量)/對照組含量×100%(公式1)

通過分析各個實驗組和對照組數據，我們可以發現：①當在肝微粒體中溫孵檳榔水煎液時，除了檳榔次堿外，其他三種生物堿含量均明顯減少；②當單獨在肝微粒體中溫孵檳榔堿時，代謝產物中檳榔次堿含量明顯增高；③當在肝微粒體中溫孵四磨湯時，除了去甲檳榔次堿含量明顯增多之外，其他三種生物堿含量均明顯減少。基于這些現象，我們補充了實驗組編號為4～7的四組實驗，以觀察另外三種生物堿單獨使用時以及四種生物堿配合使用時在肝微粒體溫孵體系中的代謝情況。通過比較實驗組和對照組數據可以發現：④當在肝微粒體中溫孵四種檳榔生物堿時，檳榔堿和去甲檳榔堿含量減少，其中檳榔堿含量明顯減少，檳榔次堿和去甲檳榔次堿含量則明顯增多；⑤當單獨在肝微粒體中溫孵檳榔次堿時，代謝產物中去甲檳榔次堿含量明顯增高；⑥當單獨在肝微粒體中溫孵檳榔堿時，代謝產物中檳榔次堿含量明顯增高；⑦當單獨在肝微粒體中溫孵去甲檳榔堿時，代謝產物中去甲檳榔次堿含量明顯升高。

3 結論

通過上述實驗我們認為檳榔堿能夠在肝微粒體中被代謝為無毒的檳榔次堿，從而達到減毒效果。而四磨湯中的某個或某些成分能夠促進肝微粒體對檳榔堿的代謝，從而達到配伍減毒的效果。

4 討論

在本文研究之前我們進行了預實驗：將12只SD雄性大鼠隨機分成兩組，分別灌胃含檳榔生藥材量一樣的檳榔水提液和四磨湯，連續3 d。結果檳榔水提液組的大鼠全部死亡，而四磨湯組大鼠則正常存活，由此現象我們認為檳榔水提液具有一定的毒性，而相同濃度下的四磨湯則沒有毒性。并且通過分析檳榔水提液中生物堿的含量，發現主要存在四種生物堿，分別為檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔次堿和去甲檳榔堿，其中去甲檳榔次堿的含量約為檳榔堿含量的3倍。所以，我們認為關于檳榔水煎液在臨床應用產生毒副作用相關的報道案例較少的可能原因之一就在于此。同時，這說明檳榔在水煎煮提取過程中，可能是由于水對檳榔堿的提取不完全或者是檳榔堿長時間加熱遭到了破壞所致，也印證古人所說的“檳榔見火無功”的說法。此外，古人在應用四磨湯的時候強調要采用“磨取汁，溫服”的方法才能起到快速發揮藥效的作用，大概的緣由之一就在于此吧。

綜上，通過我們的研究，初步認為四磨湯中存在促進檳榔堿代謝的成分，從而達到配伍減毒的效果。關于中藥配伍減毒作用機制更加清晰具體的研究有待進一步開展。