AQP1、HBx蛋白在乙肝相關(guān)性肝癌組織中的表達(dá)及其意義

雷陽，李躍文

(1、信陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 信陽 464000；2、駐馬店市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 駐馬店 463000)

乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生，考慮與長期的乙肝病毒的感染導(dǎo)致的肝細(xì)胞的異常病變有關(guān)，流行病學(xué)研究顯示，乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)病率可達(dá)234～466/10萬人左右[1]，在合并有家族內(nèi)肝癌病史或者膽道系統(tǒng)疾病的人群中，乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)病率可進(jìn)一步上升。不同的生物學(xué)因子能夠通過影響到癌細(xì)胞的生物學(xué)特征，促進(jìn)癌細(xì)胞在增殖、分化或者凋亡等過程中的調(diào)控異常，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤早期的發(fā)生及臨床進(jìn)展。水通道蛋白1（APQ1）不僅能夠參與到水電解質(zhì)的代謝過程中，同時(shí)可以影響到局部組織新生血管的形成、提高局部血管內(nèi)皮的通透性，為癌細(xì)胞的擴(kuò)散或者浸潤提供基礎(chǔ)[2]；乙肝病毒基因X開放讀框編碼的乙肝病毒X蛋白（HBx）能夠提高乙肝病毒整合入宿主喜碧的速度，提高乙肝病毒顆粒的毒性作用，提高癌細(xì)胞持續(xù)性增殖的風(fēng)險(xiǎn)[3，4]。部分研究探討了APQ1與肝癌的關(guān)系，認(rèn)為異常表達(dá)的APQ1是促進(jìn)患者肝癌臨床分期進(jìn)展的重要因素，但對于HBx與乙肝相關(guān)性肝癌的關(guān)系研究不足。為了進(jìn)一步揭示相關(guān)因子在促進(jìn)肝癌病情進(jìn)展過程中的作用，本研究選取我院手術(shù)后肝癌組織標(biāo)本80例，探討了AQP1、HBx蛋白的異常表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院手術(shù)后肝癌組織標(biāo)本80例（病灶組）、40例癌旁組織（癌旁組），收集時(shí)間2015年1月-2017年6月。病灶組，男44例、女36例，年齡 42～73 歲，平均 57.5±10.1 歲，分化程度：高分化18例、中分化35例、低分化27例；TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期28例、Ⅲ期32例；病灶直徑＞5cm 34例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。癌旁組，男22例、女 18例，年齡 44～71歲，平均 56.6±10.0歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑵患者均具有明確的HBV病毒感染病史或HBV-DNA檢測陽性；⑶患者均在我院接受肝癌根治性手術(shù)；⑷患者手術(shù)治療前未經(jīng)行放化療治療；⑸本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴轉(zhuǎn)移性肝癌；⑵未經(jīng)病理學(xué)證實(shí)；⑶手術(shù)前患者因肝癌或其他部位腫瘤已經(jīng)接受了放化療；⑷風(fēng)濕及免疫系統(tǒng)疾病。

1.3 免疫組化染色方法 所有組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后作連續(xù)切片，厚度約為4mm，采用免疫組化鏈霉卵白素一生物素復(fù)合體法 (strep avidin-biotin complex，SABC法)染色，二氨基聯(lián)苯胺(diamionben zidene，DAB)顯色。 APQ1、HBx 抗體、PV6000 通用型二抗以及SP試劑盒和DAB顯色盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。以陽性片及PBS代替一抗分別作為陽性及陰性對照，高倍顯微鏡下觀察APQ1、HBx的表達(dá)情況，具體染色步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化結(jié)果判定：APQ1、HBx蛋白的陽性著色表達(dá)于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)，⑴根據(jù)著色強(qiáng)度：0分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色；⑵根據(jù)陽性細(xì)胞比例：陽性細(xì)胞數(shù)目所占比例≤10%為1分、陽性細(xì)胞所占比例11%～50%為2分、陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分、陽性細(xì)胞數(shù)所占比例＞75%為4分，兩種積分相乘總分＜3分為陰性、≥3分為陽性。總分＜3分：“-”表達(dá)；為3～5 分，“+” 表達(dá)；為 6～9 分，“++” 表達(dá)；＞9 分，“+++”表達(dá)。。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 16.0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P值＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組組織標(biāo)本中的APQ1、HBx蛋白表達(dá)情況比較 病灶組的APQ1、HBx蛋白表達(dá)陽性率分別為71.25%、68.75%均顯著的高于癌旁組的5.00%、10.00%（P＜0.05）；見表 1、表 2。

表1 兩組組織標(biāo)本中的APQ1蛋白表達(dá)情況比較

表2 兩組組織標(biāo)本中的HBx蛋白表達(dá)情況比較

2.2 肝癌組織標(biāo)本中的APQ1、HBx蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 肝癌組織中APQ1蛋白表達(dá)與患者TNM分期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度具有顯著的相關(guān)性（P＜0.05）；肝癌組織中HBx蛋白表達(dá)陽性率與腫瘤發(fā)生門脈侵襲、TNM分期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性 （P＜0.05），見表 3、表 4。

3 討論

肝癌的發(fā)生可能與飲食習(xí)慣、遺傳、病毒感染等因素有關(guān)，合并有慢性乙型肝炎病毒感染的人群，由于長期的病毒顆粒表面糖蛋白激活導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的異常傳導(dǎo)，能夠增加肝臟上皮細(xì)胞的異常病變的風(fēng)險(xiǎn)[5，6]。乙肝相關(guān)性肝癌的患者，其病情進(jìn)展較為隱匿，容易早期發(fā)生腹腔內(nèi)臟器的轉(zhuǎn)移[7，8]。長期的臨床隨訪研究顯示，乙肝相關(guān)性肝癌的臨床治療總體有效率不足35%，治療后患者無瘤生存時(shí)間或者五年生存率等指標(biāo)均無明顯的改善[9]。而本次研究通過對于乙肝相關(guān)性肝癌發(fā)病過程中不同因子的表達(dá)分析研究，能夠?yàn)橐腋蜗嚓P(guān)性肝癌的免疫靶向治療提供理論參考，同時(shí)可以為臨床上乙肝相關(guān)性肝癌的預(yù)后隨訪提供較為可靠的參考指標(biāo)。

表3 肝癌組織標(biāo)本中的APQ1蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

表4 肝癌組織標(biāo)本中的HBx蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

APQ1作為四通道蛋白，其通道的開放能夠平衡細(xì)胞膜內(nèi)外的液體代謝，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓、離子電勢差等必要時(shí)的內(nèi)環(huán)境。已經(jīng)證實(shí)的APQ1能夠在影響到泌尿系統(tǒng)疾病的發(fā)生及病情進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的作用，而近年來相關(guān)基礎(chǔ)方面的研究顯示，APQ1還能夠在影響到腫瘤微環(huán)境的形成，提高腫瘤干細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞早期粘附及浸潤等病理過程進(jìn)展中起到作用。APQ1能夠通過對于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子a的上調(diào)作用，提高早期異常病變肝臟病灶組織細(xì)胞的血流灌注，提高腫瘤細(xì)胞的增殖活性[10]；HBx對于腫瘤相關(guān)基因的上游啟動(dòng)子區(qū)域激活作用，能夠促進(jìn)下游癌細(xì)胞周期的調(diào)控障礙，增加G1/S期的細(xì)胞比例，促進(jìn)癌細(xì)胞的分化障礙，增加低分化及凋亡抑制的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11，12]。本研究在探討了APQ1、HBx蛋白與肝癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化等關(guān)系的同時(shí)，揭示了其與患者薄膜浸潤、門脈轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌患者病灶組織中可以發(fā)現(xiàn)APQ1、HBx蛋白的顯著異常表達(dá)，其表達(dá)濃度的上升提示二者可能均參與到了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，從機(jī)制上考慮APQ1、HBx蛋白的異常表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌的關(guān)系可能與下列幾個(gè)方面的因素有關(guān)：⑴APQ1的高表達(dá)能夠直徑促進(jìn)癌細(xì)胞早期對于血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力，促進(jìn)癌細(xì)胞線粒體氧化損傷，降低染色體錯(cuò)配修復(fù)的能力；⑵HBx蛋白的高表達(dá)能夠?qū)е聦?dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)NOTCH或者AKT等信號(hào)通路的傳遞異常，增加腫瘤信號(hào)通路的交錯(cuò)式激活。王鵬等[13，14]研究者在探討了不同病情的肝癌患者的臨床預(yù)后過程中發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織異型性較為明顯，新生血管形成較為明顯的區(qū)域，HBx蛋白的表達(dá)均可以顯著上升，同時(shí)在臨近肝癌癌旁組織的區(qū)域，HBx蛋白即可發(fā)現(xiàn)顯著的表達(dá)變化。在臨床分期較晚的患者中，APQ1的表達(dá)陽性率較高，這主要與APQ1的表達(dá)對于肝癌患者的器官轉(zhuǎn)移、局部臨床正常組織的浸潤過程有關(guān)；在細(xì)胞分化程度較差或者發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的人群中，APQ1蛋白的表達(dá)陽性率可進(jìn)一步上升，這主要考慮與APQ1蛋白的高表達(dá)對于淋巴結(jié)引流、血管內(nèi)皮粘附分子或者淋巴結(jié)組織粘附分子adherin 1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[15]。但本次研究并未發(fā)現(xiàn)APQ1蛋白的表達(dá)與肝癌患者腫瘤大小或者門脈浸潤的關(guān)系，這因?yàn)槟[瘤病灶的大小主要與腫瘤的病情進(jìn)展時(shí)間、病程長短有關(guān)系，而APQ1蛋白的表達(dá)并不會(huì)影響到門脈浸潤，則提示APQ1蛋白在肝小葉中央?yún)^(qū)域可能并不具有顯著的致癌作用。肝癌組織中HBx蛋白表達(dá)陽性率與腫瘤發(fā)生門脈侵襲、TNM分期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性，表明HBx蛋白與肝癌的臨床病情同樣具有密切的關(guān)系，其中HBx蛋白對于門脈浸潤的影響，提示HBx蛋白與肝癌患者的病情關(guān)系更為密切。

綜上所述，APQ1、HBx蛋白在乙肝相關(guān)性肝癌組織中高表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。