PCR過程中生成引物二聚體回收再利用的研究

陳琪，劉曉峰

(江西省九江市第一人民醫(yī)院，九江 332000)

在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase Chain Reaction，PCR）過程中，引物的 3’端不依賴模版相互作用生成大量非特異性產(chǎn)物，尤其是引物二聚體[1]。有研究報道，在兩引物的3’端只要有一個堿基互補(bǔ)配對，30個循環(huán)即可生成引物二聚體[2]。許多實驗通過引物的優(yōu)化設(shè)計、控制反應(yīng)條件、熱啟動和酶的優(yōu)化等方法來減少引物二聚體的生成[3，4]，但引物濃度較高時，這些方法不能減少引物二聚體的生成。因此，引物二聚體被認(rèn)為是PCR反應(yīng)過程中的必然產(chǎn)物，嚴(yán)重干擾實時熒光定量PCR、反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）等實驗結(jié)果[5-7]。然而引物二聚體是否具有一定的功能，縱觀國內(nèi)外文獻(xiàn)卻鮮有報道。本實驗組利用粉塵螨1類變應(yīng)原基因的重組質(zhì)粒pET28a(+)-ProDer f 1為模版，以ProDer f 1特異性引物形成的二聚體為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出ProDer f 1基因，驗證了回收的引物二聚體依然具有特異性引物的功能，現(xiàn)將詳細(xì)結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和引物 含有粉塵螨1類變應(yīng)原基因的重組質(zhì)粒pET28a(+)-ProDer f 1和大腸埃希菌 （Escherichia colin，E.coli）DH5α 感受態(tài)細(xì)胞本實驗室自制并保持；根據(jù)GenBank公布的ProDer f 1（AB034946.1）基因序列設(shè)計特異性引物，ProDer f 1-F：TATGGATCCCGTCCAGCTTCAAT CAAAACT，ProDer f 1-R：GGCCTCGAGTCACATG ATTACAACATATGG，理論擴(kuò)增出目的基因為912bp。

1.1.2 主要試劑和儀器 SK2072即用PCR擴(kuò)增試劑盒 （Taq）、SanPrep柱式 DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、250bp DNA Marker(SM0311)、50bp DNA Marker(BSM0371)均購自生工生物工程 （上海）有限公司；ABI2720型PCR儀、Beckman高速冷凍離心機(jī)、Bio-Rad水平電泳儀、SYNGENETM凝膠電泳成像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 引物二聚體的生成與回收 生成引物二聚體PCR 體 系 （27μl）：10 ×PCR Buffer 2.5μl，MgCl2（25mmol/L）2μl，dNTPs （2mmol/L）2.5μl，ProDer f 1正、 反向引物各 0.5μl，Taq DNA 聚合酶（5U/μl）0.5μl，ddH2O 18.5μl，蘸取含有 pET28a(+)-ProDer f 1的陽性菌落吹打混勻。反應(yīng)條件：94℃ 5min，94℃30sec、55℃ 30sec、72℃ 30sec，35 個 循 環(huán) ，72℃10min。PCR產(chǎn)物行 1%瓊脂糖凝膠電泳（90V，50min）并拍照。按SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒說明書切膠回收引物二聚體。

1.2.2 以回收的二聚體為引物的PCR PCR體系（40μl）：10×PCR Buffer 5μl，MgCl2（25mmol/L）2μl，dNTPs （2mmol/L）2.5μl， 回收的引物二聚體 10μl，Taq DNA 聚合酶（5U/μl）0.5μl，ddH2O 20μl，蘸取含有pET28a(+)-ProDer f 1的陽性菌落吹打混勻。反應(yīng)條件：94℃ 5min，94℃ 30sec、55℃ 30sec、72℃30sec，35個循環(huán)，72℃ 10min。同樣反應(yīng)體系條件下以DH5α陰性菌為模板和未加引物二聚體的陽性菌做模板的PCR產(chǎn)物為陰性對照。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳 （90V，50min）并拍照。按SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的序列比對 ProDer f 1特異性引物PCR產(chǎn)物和二聚體為引物的PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序（由生工生物工程有限公司完成），并用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對分析。

2 結(jié)果

2.1 引物二聚體的生成與回收 ProDer f 1特異性引物的菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，目的基因在1000bp左右出現(xiàn)特意條帶，同時生成的引物二聚體（Primer Dimer，PD）也出現(xiàn)模糊條帶（圖1A）。切膠回收引物二聚體，回收產(chǎn)物在50bp～200bp之間出現(xiàn)模糊條帶（圖1B）。

2.2 以二聚體為引物的PCR 以二聚體為引物的菌落 （陽性）PCR產(chǎn)物和以ProDer f 1特異性引物的菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，兩者在相同位置出現(xiàn)特意條帶，且和ProDer f 1基因一致；而以二聚體為引物的陰性菌落PCR未出現(xiàn)特異條帶（圖 2）。

圖1 A：ProDer f 1特異性引物的菌落PCR過程中生成的引物二聚體

圖2 1：ProDer f 1 基因，2：ProDer f 1特異性引物的陽性菌落PCR產(chǎn)物，3：以二聚體為引物的陽性菌落PCR 產(chǎn)物，4：ProDer f 1特異性引物陰性菌落PCR產(chǎn)物，5：以二聚體為引物的陰性菌落PCR產(chǎn)物

2.3 序列比對ProDer f 1特異性引物PCR產(chǎn)物和二聚體為引物的PCR產(chǎn)物的序列經(jīng)DNAMAN軟件比對，同源性達(dá)98.68%，兩者同ProDer f 1基因比對，同源性達(dá)99.56%，但以二聚體為引物的PCR產(chǎn)物序列3’端的CGT和5’端的CAT 3個堿基缺失，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3 討論

螨性變應(yīng)原是引起哮喘等過敏性疾病的主要變應(yīng)原[8-10]，螨性變應(yīng)原基因一直以來是研究的熱點[11，12]，而特異性引物是變應(yīng)原基因擴(kuò)增和鑒定的重要試劑，引物二聚體的生成不僅嚴(yán)重影響實驗的結(jié)果，也是對實驗試劑的浪費(fèi)。本實驗利用回收的二聚體為引物，對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出目的基因，并通過序列比對證明其PCR產(chǎn)物與特異性引物的PCR產(chǎn)物同源性高達(dá)98.68%。分析其原因可能為：⑴引物二聚體是PCR過程中形成的非特異性產(chǎn)物，大小不一（多為50-250bp），其中可能含有特異性引物的序列片段；⑵引物二聚體解鏈溫度要低于目的基因[13]，部分二聚體解鏈后發(fā)揮引物作用。同時我們也看到，以二聚體為引物PCR產(chǎn)物的條帶較特異性引物PCR產(chǎn)物的條帶暗，且較傾向于生成較多的引物二聚體；由此推論，引物二聚體可能具有正反饋作用，以鏈?zhǔn)叫?yīng)促進(jìn)更多二聚體的生成。

引物二聚體的形成干擾實驗結(jié)果的報道很多，但其也具有一定的功能效應(yīng)。吳崇軍[14]等利用引物二聚體形成的原理，建立了一種新的克隆目的基因的方法；本實驗以回收的二聚體為引物，PCR擴(kuò)增出目的基因，且和特異性引物的PCR產(chǎn)物具有高度的同源性，證明其具有引物功能。因此，我們可以認(rèn)為，引物二聚體既可以作為目的基因擴(kuò)增的模版，同時還具有特異性引物的功能。