有機納米材料的應用及分析方法研究進展

林 悅，劉 倩，林振宇，江桂斌

(1.中國科學院生態環境研究中心，環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085；2.福州大學 化學學院 食品安全與生物分析教育部重點實驗室，福建 福州 350108)

納米技術是對納米尺寸范圍內的物質進行研究、控制和應用的技術。近年來，由于納米技術的不斷發展和應用，納米材料已被廣泛地應用于食品、生物醫藥、農業以及環境等領域。納米材料由于其納米級別的尺寸效應而具有的獨特物理和化學性質，為食品、農業、工業等領域帶來了新的創新發展機遇[1]。但近年來的研究也表明，納米材料能夠通過生物膜進入細胞、組織和器官，影響其正常的生理活動，甚至引發一些疾病。因此，對納米材料的安全性研究顯得尤為重要。發展納米材料的表征與分析技術是其廣泛應用和安全性研究的基礎。納米材料可分為有機納米材料、無機納米材料以及有機無機雜化納米材料。目前，針對無機納米材料，已有大量新型高效的分析和表征技術被報道。相比之下，對有機納米材料分析方法的研究關注較少。由于有機納米材料在有機溶劑中性質不穩定以及與基質成分的相似性，使得有機納米材料的分析檢測成為一大挑戰[2-4]。然而，近幾年納米材料的應用展現出從無機納米材料到有機納米材料的發展趨勢[5-6]。因此，對有機納米材料的分析和表征十分重要。本文主要對目前有機納米材料的應用概況及其分析表征方法進行了系統的歸納總結。

1 有機納米材料的應用概況

1.1 有機納米材料在食品工業中的應用

近年來，納米技術以及納米材料已廣泛應用于食品工業的各個階段[7-9]。食品添加劑的加入能夠改變食品的性質結構以及延長食品的貯存期。一些具有功能性和生物活性的化合物能夠被封裝在納米級別的載體中加入到食品中，從而保護其生物活性，抑制其生物降解，改善其穩定性及水溶性[10]。許多類型的有機納米粒子能夠作為一種性能良好的載體[11]，例如，德國AquaNova公司生產的一種納米自組裝的脂質體產品，能夠裝載維生素A、C、E、K、輔酶Q10、β胡蘿卜素、異黃酮、α-硫辛酸等多種營養物質，通過改善這些營養物質活性部分的溶解度或水溶性或脂溶性，促進營養物質在食品中的分散，同時也有利于食品在人體內的消化和吸收。另外，食品中還有一些天然存在的有機納米粒子，如牛奶中的乳清蛋白能夠自組裝形成40 nm左右的顆粒，而95%的酪蛋白能夠自組裝成50～500 nm的微膠粒。由于作為食品添加劑的有機納米材料必須是食品級別的材料，所以工業合成的聚合物納米粒子一般不能應用于食品中，只有一些食品級的聚合物才能應用于食品加工中。但聚合物納米粒子可以用于食品包裝[12-13]，且摻雜其它納米材料后的復合材料能夠有效保持食品的新鮮度。尤其是其優異的阻氣性，適用于堅果、干糧和零食的包裝[14-17]。另外，一些具有功能性的天然生物聚合物(如殼聚糖)作為食品包裝材料也是一種很好的選擇[18-19]。

1.2 有機納米材料在生物醫藥中的應用

納米科技的發展使納米治療藥物也得到了迅速發展。脂質體作為藥物的載體在近十幾年得到了廣泛應用。通常脂質體呈球形，大小在25～1 000 nm 之間，能夠高效裝載親水或疏水藥物，從而保護藥物不受外界環境的影響。同時，易修飾易功能化的特點使其可以識別特定的目標物，或進一步改善脂質體的性質。阿霉素脂質體是美國食品及藥物管理局批準的第一個脂質體藥物配方，用于治療與卡波西肉瘤有關的艾滋病。多倫多大學的鄭鋼課題組合成了一種磷脂包裹的卟啉有機高分子納米材料，該材料在體內能夠降解，可用于光熱治療[20-21]。多糖是一種在植物、動物、藻類、微生物中天然存在的化合物。目前，殼聚糖和淀粉是生物醫學及制藥中最常用的多糖納米材料，它們具有天然的生物相容性以及可降解性，因此成為一種絕佳的納米藥物載體材料，可用于疫苗和一些口服藥物的載體[22]。另外，合成的高分子聚合物納米材料雖然一般不能用于食品添加劑中，但已被廣泛地應用于生物醫藥行業[23-24]。與食品中作為營養物質的載體類似，它們同樣可用來保護和運輸具有生物活性的化合物。

1.3 有機納米材料在農業中的應用

有機納米材料在農業生產方面也得到了廣泛應用，包括農業投入品、植物遺傳育種、農產品加工等[25]。利用納米技術可將一些有機農藥或化肥納米化，形成納米尺寸的乳液，提高其在水中的分散性，有助于農作物的吸收[26]。Jiang課題組[27]合成了一種環保型草甘膦異丙胺納米乳液體系，該體系能夠增加草甘膦異丙胺的滲透性和吸收性。γ-氟氯氰菊酯固體脂質納米粒子能夠保持其滅蟲性，且大大降低了對魚類和植物的毒性。基于脂質體的納米粒子已被用作一種納米載體運輸一些農藥產品，以控制或降低農藥的運輸速度，延長農藥的持效期，提高其藥效[28-31]。近年來，納米技術在植物育種方面也取得了進展。納米材料能夠作為一種基因載體，負載外源基因，實現靶向性轉運，進而成功培育出轉基因植物。常用的有機高分子納米材料基因載體有脂質體、聚乙烯亞胺、殼聚糖、樹枝狀高分子聚合物、聚賴氨酸等[32]。另外，有機納米材料也可作為一種動物飼料添加劑。例如，聚苯乙烯納米粒子加入到雞飼料中能夠與飼料中的細菌結合，進而通過雞的胃腸道和其他排泄物聚集[33]。

1.4 有機納米材料在環境中的應用

環境中的有機納米材料覆蓋了以上所有類型，食品、農產品、醫藥產品中含有的有機納米顆粒均可能通過直接或間接的方式排入自然環境中，成為一類新型的環境污染物。此部分重點介紹近年來關注度較大的微塑料。微塑料一般是指尺寸小于5 mm 的塑料微粒、微纖維、塑料薄膜及薄膜等，而尺寸小于100 nm的塑料顆粒被稱為納米塑料。如今塑料已經廣泛地應用于工業、農業、建筑、包裝以及人們日常生活的各個領域。2017年我國的塑料制品行業產量達到706.7萬噸，其數量十分龐大，主要包括低密度聚乙烯、高密度聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯等[34]。這些塑料主要被加工成包裝袋、塑料管和乙烯基覆層等外殼部件。一旦被廢棄后排入環境中，這些塑料通常進入水道并最終排入海洋中。之后經過長期的外界作用形成尺寸越來越小的顆粒，最后部分達到納米級別，形成納米塑料。這些納米塑料很容易被浮游生物及魚類攝入，并在體內不斷累積，最終可能通過食物鏈進入人體內，對人體健康產生潛在的危害。而且納米塑料具有很大的比表面積，可以作為一些有毒物質的載體，例如持久性有機污染物、金屬以及農藥等。這些有毒物質負載在納米塑料上，隨著海水流動而大范圍擴散，對海洋生物乃至人類健康產生危害[35-37]。表1列出了有機納米材料在食品、生物醫藥、農業以及環境領域中的應用。

表1 有機納米材料的應用領域Table 1 Typical applications of organic nanomaterials

2 有機納米材料的分析方法

檢測有機納米粒子的困難在于，其存在的樣品基質與目標分析物性質相似導致兩者分離困難，因此對樣品的前處理方法是首要解決的一大難題。目前，分析方法研究大部分集中于無機納米粒子，對有機納米粒子檢測方法的開發仍處于起步階段[38,41]。但根據近期調查，納米材料的應用表現出由無機納米材料向有機納米材料發展的趨勢，尤其在食品、農業等領域，有機納米材料的應用正處于快速增長的階段，因此開發對有機納米材料的分析檢測方法愈發重要。目前對有機納米材料的分析方法研究主要包括樣品處理、分離、成像、檢測等內容(圖1)。

圖1 有機納米材料的分析流程及方法
Fig.1 Analytical procedures and methods of organic nanomaterials
HPLC：高效液相色譜；SEC：尺寸排阻色譜法；HDC：流動色層分析法；FFF/F4：場流分離/流場流分離技術；GE：凝膠電泳；CE：毛細管電泳；IMS：離子遷移譜；DMA：差分遷移率分析；TEM：透射電子顯微鏡；SEM：掃描電子顯微鏡；AFM：原子力顯微鏡；DLS：動態光散射；NTA：納米顆粒跟蹤分析；MALDI-TOF-MS：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜；ESI-MS：電噴霧電離質譜；Pyr-GC-MS:熱裂解色譜-質譜聯用技術

2.1 樣品處理與分離

在對有機納米粒子進行表征與檢測前需對樣品進行前處理，包括消解、分離、富集和純化。特別是基質復雜的樣品，在處理的過程中需保證待測粒子不受損壞且最大程度地被富集，以得到最佳的檢測性能。常見的樣品處理方法有過濾、離心等[42]。傳統的過濾方法能富集樣品中一定粒徑范圍的顆粒，通過選定不同孔徑的濾膜(如0.2、0.45、1 μm)，按梯度過濾，能夠較好地解決濾孔堵塞的問題。其次，超濾也能高效地富集有機納米顆粒，選定截留分子量30 kDa的超濾管進行離心分離，能夠有效去除金屬離子及小分子[43]。切向流過濾(TFF)是透析的一種形式，具有穩定、快速、不易堵塞、重復性好等優點[44]，其中電輔助TFF已被用來分離蛋白質納米粒子[45]。另外，超速離心也是一種快速富集水樣中納米粒子的方法，通過設置不同的轉速進行梯度離心，能夠粗略地分離不同粒徑的納米粒子[46]。但是，過濾或離心均會使樣品中的其它無機納米顆粒被富集，難以與有機納米粒子分離，因此在過濾或離心前或處理過后仍需將二者分離。Karami課題組[47]利用密度為1.6～1.8 g·cm-3的NaI飽和溶液分離魚樣品中的微塑料及納米塑料。由于塑料的密度低于NaI,因此經過一定時間的靜置，密度較小的塑料顆粒懸浮在液體表面，密度大的其他納米粒子(如金屬納米粒子)沉于底部。另外，從一些復雜的生物樣品中提取聚合物有機納米粒子時，還需采用消解的方法對樣品進行預處理，去除基質干擾。通常采用酸性消解、堿性消解或生物酶消解等方式。但是，消解法并不能普遍適用于有機納米粒子，因為酸、堿或其他強氧化性溶劑對基于蛋白、脂質體的有機納米粒子具有破壞作用。無論采用哪種樣品前處理方式或試劑處理樣品，均需保證不破壞待測的目標納米粒子，并且不損壞儀器的檢測系統。

目前，大部分的檢測方法均無法實現有機納米粒子的原位檢測，因此樣品的制備技術和分離技術十分重要。除了過濾、離心這些通用的處理方法外，還有一些分離方法能夠根據有機納米粒子的尺寸、形狀、電荷等物理化學性質進行比較精確的分離，例如色譜分析、場流分離(FFF)、電泳、離子遷移譜(IMS)等。其中，流動色層分析法(HDC)是色譜分析的一種方法，能與幾種檢測體系相結合，目前應用最廣的是與紫外可見光譜(UV-Vis)相結合用于納米粒子(如脂質體納米粒子)的分析[48]。FFF是一種流動輔助分離技術，可以用于分離大分子納米粒子以及微米級別的顆粒(例如細胞)。流場流分離技術(F4)是應用最廣泛的FFF技術，特別適用于分離完整的超大蛋白質和蛋白質復合物[49]。電泳包括凝膠電泳(GE)和毛細管電泳(CE)，其原理是利用帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，不同的帶電粒子因在電場中移動速度不同而達到分離[50]。這種技術已實現了DNA、RNA、蛋白質等生物大分子的分離。另外IMS或差分遷移率分析(DMA)也可用于有機納米粒子的分離，且IMS常與MS聯合(IMMS)用于納米粒子的分離和檢測[7]。

2.2 表征與檢測方法

2.2.1電鏡法成像是表征納米材料的最重要技術之一，常用的有電子顯微鏡(TEM、SEM)和AFM等。TEM已被用于不同條件下的乳蛋白納米管、血清白蛋白納米粒子以及淀粉基納米粒子的成像表征。通過TEM能夠觀察到有機納米粒子的尺寸與形狀，例如淀粉基納米粒子在TEM下可觀察到50～180 nm范圍內的大小[51]。同樣，SEM能夠得到目標物納米粒子的尺寸、形狀以及樣品表面狀況的高清圖像。Nuruzatulifah課題組[52]采用場發射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)觀察到合成的聚苯乙烯納米粒子呈40～60 nm的球狀(圖2)。另外，SEM 能夠觀察到基于多糖、蛋白、脂質體的納米粒子。但是，這些有機納米粒子必須先從樣品基質中分離出來，才能得到清楚的成像結果。AFM的分辨率能夠達到0.1 nm,幾乎能夠對任何類型表面的納米材料進行成像，包括聚合物、陶瓷、復合材料、玻璃和生物樣品，并得到高分辨率的三維輪廓圖。例如，AFM已被應用于緩沖液中α-乳清蛋白納米管分子結構成像，探測其機械性質，且分辨率可達到納米級別，此外，該技術還用于對脂質納米粒子的大小、形狀、穩定性和動態過程進行研究[38]。

2.2.2光譜法蒸發光散射檢測器(ELSD)是一種通用型檢測器，可與一些色譜分離方法聯合用于無紫外吸收的有機物的檢測。如Schulzova等[11]將超高效液相色譜(UHPLC)、尺寸排阻色譜法(SEC)和ELSD聯合用于飲料中有機納米粒子的表征與檢測，得到飲料和水中聚山梨醇酯納米粒子的檢出限分別為0.5 mg/mL和0.1 mg/mL。

動態光散射(DLS)是檢測納米粒子粒徑的常規方法，檢測結果會受環境中塵土以及樣品中聚集粒子的影響，但同時具有檢測快速、簡便、重復性強等優點。DLS能夠對一些基于蛋白、多糖脂質體的納米材料進行表征，同時也常應用于一些合成的聚合物納米材料的粒徑表征。Calle等[2]用DLS快速鑒別了飲料中納米粒子的粒徑，并得到了對納米粒子粒徑影響最小的前處理方式。另外，與DLS相關的還有納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術，其能夠分析30～2 000 nm粒徑范圍的粒子[53]。

UV-Vis可用于檢測在紫外可見光波長區域具有吸收譜帶的有機納米材料。HDC法能與UV檢測聯合用于有機納米粒子尺寸的表征。Oosterbroek等[54]在芯片平面上結合HDC和UV吸收檢測，用于一些聚合物、生物聚合物顆粒的尺寸表征。裝置包含1個孔道(高1 μm、寬0.5 mm、長69 mm)、1個150 pL 注射裝置和1個檢測池(深30 μm、寬30 μm)用于UV吸收檢測。傅立葉變換-紅外光譜分析法(FT-IR)和拉曼光譜(Raman)法常被用于表征分析環境中的微塑料成分。L?eder等[55]利用基于焦平面陣列探測器的微傅立葉變換紅外成像技術對環境樣品中的微塑料進行分析，該方法分析速度快，可以滿足小粒徑微塑料的檢測及區域范圍的檢測，實現了樣品的可視化。Wu等[56]對青藏高原偏遠湖泊的湖岸沉積物進行分析，并通過激光拉曼光譜從微塑料樣品中鑒定出聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯和聚氯乙烯。另外，微塑料還能用尼羅紅熒光染料法進行表征和計數，但該法一般僅能測定微米級別甚至更大尺寸的高分子材料。

圖3 由聚乙烯(PE)(藍色圓圈)和頂部渥太華砂粒(綠色圓圈)組成的樣品的總離子TOF-SIMS 成像圖(ca.500 μm×500 μm)[57] Fig.3 TOF-SIMS image(ca.500 μm×500 μm)of total ions from a sample consisting of PE(blue circle)and Ottawa sand grains on top(green circles)[57]

2.2.3質譜法質譜正在納米材料的分析領域興起，并被證明具有很好的應用前景。Jungnickel等[57]用飛行時間二次離子質譜(TOF-SIMS)對模擬暴露于海浪中的聚乙烯微粒(PE)進行了分析和成像(見圖3)。另外，熱裂解色譜-質譜聯用技術(Pyr-GC-MS)也被廣泛應用于高分子聚合物的定性與定量，通過對樣品進行加熱使其熱裂解，釋放出小分子短鏈，根據短鏈分子的m/z判斷樣品類型。例如，用Pyr-GC-MS檢測聚苯乙烯納米粒子，能夠得到苯乙烯(m/z104)、聚苯乙烯二聚體(m/z208)、聚苯乙烯三聚體(m/z312)的特征峰[58]。

色譜是一種分離有機納米粒子的有效方法，而色譜與質譜的聯用能夠進一步識別這些納米粒子。液相色譜和質譜的聯用能夠有效地分離和檢測復雜樣品中的蛋白、多肽等大分子，表明這些技術適用于表征生物聚合物納米粒子。Schulzova等[11]將超高效反相液相色譜與高分辨率時間質譜(UHPLC-HRTOF-MS)結合，建立了一種高選擇性和靈敏度的聚山梨醇酯納米粒子的檢測和定量方法。還采用實時直接分析離子源與Orbitrap MS分析儀(DART-Orbitrap MS)相結合，快速簡便地檢測了飲料中的聚山梨醇酯納米粒子。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)是一種高效的新型軟電離生物質譜，其質量檢測范圍達到400 kDa以上，因此十分適用于一些多糖、多肽、高分子聚合物的檢測。盡管MALDI-TOF-MS已被廣泛用于分析合成聚合物的分子量和結構及組成信息，但該技術的局限性在于不能為具有高度多分散性的樣品提供正確的分子量值。而色譜法與MALDI-TOF-MS的聯用則能夠很好地克服此缺點。Helsper等[59]將HDC與MALDI-TOF-MS聯用對飲料中的脂質體納米粒子進行表征，首先通過HDC分離出3種不同尺寸的脂質體納米粒子，然后通過MALDI-TOF-MS分別在正離子和負離子模式下進行測定。各種類型有機納米粒子的檢測技術如表2所示。

表2 有機納米粒子的分析技術Table 2 The analytical techniques of organic nanoparticles

3 結論與展望

隨著有機納米材料應用的不斷增加，其分析與檢測得到越來越多的重視。本文簡述了有機納米材料的應用領域，總結了關于有機納米材料的分析方法，并概括了這些方法和技術的優缺點。與無機納米材料相比，對有機納米材料的分析方法仍被忽視，不能滿足其日益蓬勃的發展需求。對于有機納米粒子的分析檢測往往并不能通過單一的技術完成，需要多種技術聯用才能實現較好的分析與表征。未來還需從以下方面開展更多的工作：

① 針對更多類型有機納米材料的分析與檢測方法的開發。目前在農業、食品、生物醫藥等領域的有機納米材料應用仍缺乏相關標準，給質量控制和監管帶來了極大困難，尤其是缺乏可靠的分析方法對產品中的有機納米材料進行分析和檢測。因此，亟需針對不同樣品介質中的不同類型有機納米材料開發相應的分析方法。

② 大力發展有機納米材料的色譜和質譜分析技術。質譜能夠提供質量數和化學組成信息，將其與色譜、DLS、TEM等方法聯用能夠有效地實現有機納米材料的分離、表征和檢測，因此該技術在未來有機納米材料研究方面具有重要的應用潛力[67]。目前關于有機納米材料的質譜分析方法相對較少。例如，近期研究較多的微/納米塑料，仍缺乏相應的質譜分析方法，給其定性、定量帶來了困難。

③ 開發復雜介質中有機納米材料的提取技術。對于有機納米粒子的提取也是一大挑戰。由于有機納米粒子結構性質較不穩定，且通常展現出與樣品基質(如組織、細胞)類似的組成，一些適用于無機納米粒子的樣品處理方式(如超聲、化學生物降解等)并不普遍適用于有機納米粒子的提取。因此，亟需針對有機納米材料開發出特定的高效提取技術。

總之，有機納米材料的快速發展和應用給分析化學工作者提出了更多的挑戰和更高的要求，未來將會成為分析化學研究的一個熱點。