超高效液相色譜-串聯質譜法測定蓮藕、蓮葉、蓮子、田泥與田水中12種農藥殘留

張新忠,陳宗懋,趙梅勤,姚月鳳,繩慧珊,王新茹,周 利,羅逢健

(1.中國農業科學院茶葉研究所 農產品質量安全研究中心，浙江 杭州 310008;2.農業部茶葉產品質量安全風險評估實驗室，浙江 杭州 310008；3.浙江天豐生物科學有限公司，浙江 金華 321025；4.山東農業大學 農學院，山東 泰安 271018；5.天津農學院 園藝園林學院，天津 300384)

蓮藕種質資源豐富，兼具食用性和藥用性，營養豐富，含有大量利于人體健康的營養成分，因特殊的風味和保健功能而廣受國內外消費者歡迎。隨著種植業結構調整，蓮藕栽培已成為我國一些地區的特色農業[1]。近年來，干蓮葉作為一種特色茶——蓮葉茶在市場上也有銷售。噴施除草劑等農藥可防治蓮藕田病蟲草害，降低人工成本，提高蓮藕種植的經濟效益，但也可能導致蓮藕及蓮葉、蓮子中的農藥殘留；另外，整個現代農業體系中農藥的使用、環境的惡化導致蓮藕的生長環境發生變化，田水、田泥中殘留的化學農藥，也可能會傳遞富集到蓮藕及蓮葉中,導致蓮藕及蓮葉、蓮子中的農藥殘留，影響蓮藕及蓮葉、蓮子質量安全。

蓮藕、蓮子和蓮葉屬于區域性特色小宗農產品，特殊性強，國內外目前對其中農藥等污染物殘留研究較少，僅有少量文獻報道[4-9]。如王赟莘等[4]利用固相萃取(SPE)柱凈化，高效液相色譜法(HPLC)測定了水生蔬菜中22種殺蟲劑、殺菌劑農藥殘留；喻磊[5]利用固相微萃取結合氣相色譜電子捕獲檢測器法(GC/ECD)、氣相色譜質譜法(GC-MS)和HPLC分析了蓮藕、荸薺和茭白中的農藥殘留；Miao等[6-7]對比了QuEChERS提取凈化和SPE柱凈化，建立了GC/ECD和GC-MS分析蓮子中36種有機氯類、擬除蟲菊酯類農藥殘留的分析方法；戴守輝等[8-9]利用加速溶劑萃取，手性氣相色譜-質譜法研究了蓮藕中多氯聯苯手性對映體的選擇性富集行為；沈迎春等[1]研究了嘧菌酯、多菌靈和丙環唑對蓮藕葉斑病的防治效果和殘留試驗。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀，UPLC-Quattro Premier XE配有電噴霧電離(ESI)源和MassLynx 4.1工作站(美國Waters公司)；高速離心機(德國Sigma公司)；電子分析天平(0.000 1 g和0.01 g，瑞士Mettler-Toledo公司)；R-210旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司)；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；T-18高速均質勻漿器(德國IKA公司)；DFT-200手提式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；Vortex Genie2型渦旋振蕩器(美國Scientific Industries)；MZ 2C型真空抽氣泵(德國Vaccubrand公司)；6位玻璃大體積負壓固相萃取裝置、50 mL離心管、0.22 μm Filter Unit濾膜(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，Honeywell Burdick & Jackson，韓國SK Chemicals)；無水硫酸鈉、氯化鈉(分析純，上海試四赫維化工有限公司)；乙酸銨、甲酸(色譜純，德國CNW公司)；純凈水(杭州娃哈哈有限公司)；BondElut C18-SPE柱(500 mg/6 mL，美國Agilent公司)；PestiCarb-SPE柱(500 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司)。

10 mmol/L乙酸銨溶液：稱取0.78 g乙酸銨，加入純凈水并定容至1 000 mL，溶解超聲脫氣，現配現用。

0.1%甲酸乙腈溶液：準確吸取1.0 mL甲酸，加入乙腈并定容至1 000 mL，混勻超聲脫氣，現配現用。

空白蓮藕、蓮葉、新鮮蓮子(剝殼得到蓮子肉、蓮子殼)、田泥和田水均采自湖南張家界種植基地。蓮藕切成1 cm以下小段，再切碎，用高速萬能粉碎機打碎；蓮葉先切成1 cm×1 cm左右小塊，再用高速萬能粉碎機打碎；新鮮蓮子剝殼成蓮子肉、蓮子殼，再分別用高速萬能粉碎機打碎；田泥去石塊和植物根莖，晾干壓碎過20目篩；田水用濾紙過濾掉固體顆粒；上述樣品制備好均存放于-20 ℃冰箱中備用。

1.2 色譜-質譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；樣品盤溫度：8 ℃；流量：0.25 mL/min；流動相：0.1%甲酸乙腈(A)和10 mmol/L乙酸銨溶液(B)；梯度程序洗脫：0～1.0 min，15%～40% A；1.0～5.2 min，40%～90% A；5.2～5.3 min，90%～100% A，保持1.3 min；6.6～6.8 min，100%～15% A，平衡保持1.2 min。

電噴霧正電離-多反應監測掃描模式(ESI+-MRM)；電噴霧電壓：3.0 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；錐孔反吹氣：N2，50 L/h；脫溶劑氣：N2，650 L/h；碰撞氣：Ar，0.35 mL/min；倍增電壓：650 V；二級質譜母離子駐留時間：20 ms；其他參數見表1。

表1 12種農藥的ESI+-MS/MS測定條件及相關信息Table 1 ESI+-MS/MS conditions for the residue determination and related information of twelve pesticides

*quantitative daughter ions(ion ratio)

1.3 樣品處理

1.3.1蓮藕、蓮葉、蓮子肉、蓮子殼及田泥稱取磨碎后的蓮藕、蓮葉、蓮子肉、蓮子殼或田泥(其中蓮葉、蓮子殼、蓮子肉為5.00 g，蓮藕、田泥為10.00 g)，置于50 mL塑料離心管中，加10 mL水渦旋混勻，放置30 min，再準確加入20 mL乙腈渦旋浸泡過夜，于17 400 r/min均質2 min，渦旋，加2.5 g NaCl渦旋振蕩混勻后，超聲提取10 min，5 000 r/min離心5 min，準確分取上層乙腈層10 mL至雞心瓶，45 ℃下旋轉蒸發濃縮近干，加2 mL乙腈超聲溶解，上樣至500 mg/6 mL PestiCarb-SPE柱，棄去流出液，再加20 mL乙腈-苯(3∶1，體積比)洗脫，合并接收流出液至50 mL雞心瓶，45 ℃下旋轉蒸發濃縮近干，室溫下N2吹干，加1.0 mL乙腈-水(1∶1,體積比)超聲溶解后，過0.22 μm濾膜至進樣瓶，UPLC-MS/MS進樣5 μL，基質外標法定量測定。

1.3.2田水量取50 mL田水樣，上樣至依次經5 mL乙腈、5 mL水活化的500 mg/6 mL BondElut C18-SPE柱上，5 mL水淋洗，10 mL乙腈洗脫，接收流出液至50 mL雞心瓶，45 ℃下旋轉蒸發濃縮近干，室溫下用N2吹干，加1.0 mL乙腈-水(1∶1)超聲溶解，過0.22 μm濾膜至進樣瓶，UPLC-MS/MS進樣5 μL，基質外標法定量測定。

1.4 標準溶液配制與標準曲線

分別稱取0.010 0 g標準品，用乙腈溶解至50 mL容量瓶并定容，配制成200 mg/L的標準儲備液，-18 ℃下避光保存。將12種單標儲備液，用乙腈稀釋混合配制成20 mg/L的中間標準溶液，然后用乙腈-水(1∶1)稀釋成2.50、1.0、0.50、0.25、0.10、0.05、0.025、0.010、0.005 mg/L系列混合標準工作溶液，同時用經“1.3”方法得到的空白樣品(蓮藕、蓮葉、蓮子肉、蓮子殼、田泥和田水)基質配制相應濃度的基質標準溶液，采用UPLC-MS/MS進樣5 μL測定，每個樣品進樣3次，以12種農藥的質量濃度為橫坐標(X)，3次進樣提取離子對峰面積的平均值為縱坐標(Y)，進行曲線擬合，并計算基質效應結果。

1.5 回收率與相對標準偏差

稱取經“1.2”和“1.3”方法處理測定不含所測12種農藥殘留的空白樣品，分別對應添加0.05 mg/L(低)、0.50 mg/L(中)和5.0 mg/L(高)質量濃度的混合標準溶液1.00 mL(相當于蓮葉、蓮子殼、蓮子肉添加0.01、0.10、1.0 mg/kg；蓮藕、田泥添加0.005、0.05、0.50 mg/kg)，田水中添加水平為0.1 μg/L(低)、1.0 μg/L(中)、10.0 μg/L(高a)和100 μg/L(高b)，所有加標樣品渦旋混勻后放置2 h，以更接近于實際樣品，然后按照“1.3”樣品處理方法進行提取凈化，每個加標水平重復6次；同時用提取凈化后獲得的空白樣品基質溶液，配制相應濃度的基質標準溶液，基質標準外標法進行測定，計算加標回收率、相對標準偏差及方法定量下限。

1.6 實際樣品測定

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜條件優化與裂解分析

本研究利用BEH C18柱進行分離分析，對比了甲醇、乙腈以及加甲酸作為流動相A，純水、乙酸銨水溶液、甲酸銨水溶液等作為流動相B的效果。結果表明流動相中加入甲酸或銨鹽，有助于提高化合物的離子化響應，對于茚蟲威等化合物，流動相中加入銨鹽比純水和甲酸更有助于抑制[M+Na]+生成，從而有利于獲得二級質譜分析時所需的母離子[M+H]+，提高二級質譜響應[11]；乙腈比甲醇洗脫能力強，柱壓低更適合快速分析，同時因樣品進樣溶劑為乙腈-水，乙腈作為流動相時的色譜峰形優于甲醇。實驗對比了不同錐孔電壓(10、20、30、40、50 V)下，12種化合物準分子離子峰的色譜峰面積，結果表明大部分化合物的響應最大值在20 V或30 V條件下。選擇的最佳錐孔電壓見表1。

圖1 戊菌唑(A)和異丙甲草胺(B)準分子離子峰的二級質譜裂解途徑Fig.1 ESI+-MS/MS fragmentation pathways of penconazole(A) and metolachlor(B) quasi-molecular ion peaks

戊菌唑(m/z284.07)和異丙甲草胺(m/z284.14)的分子量接近，在低分辨率的四極桿質量分析器中無法完全通過準分子離子峰[M+H]+質荷比分離定性，而且二者的色譜保留時間一致，依靠保留時間亦無法定性，選擇[M+H]+離子m/z284.1進行二級質譜裂解分析，以5 V為間隔，從5 V到50 V不斷增加二級碰撞能量，研究戊菌唑和異丙甲草胺在10、20、30、40、50 V碰撞能量下的二級質譜圖。通過質譜裂解首次發現戊菌唑[M+H]+m/z284.1在二級碰撞裂解下，生成子離子m/z173、m/z159、m/z123、m/z89和m/z70，推測碎片裂解途徑見圖1A；異丙甲草胺[M+H]+m/z284.1在二級碰撞裂解下，生成子離子m/z252、m/z176、m/z145、m/z134、m/z133、m/z132、m/z119、m/z91和m/z77，推測碎片裂解途徑見圖1B。由此可見，戊菌唑和異丙甲草胺雖然母離子一致，但由于化合物結構不同，二級質譜裂解途徑不同，子離子碎片存在差別，最終可根據子離子不同，選擇不同的母離子-子離子對對兩者進行定性定量區分。

最終優化后12種農藥的二級質譜分析條件見表1，以不同的母離子-子離子對提取峰面積進行定量。

2.2 樣品前處理條件的優化

蓮葉、蓮子殼所含葉綠素較多，蓮藕、蓮子肉所含淀粉較多，田泥沉積物較多，且本文所選農藥涉及種類多、水溶解度和極性跨度大。12種農藥均易溶于乙腈、丙酮等有機溶劑，采用乙腈提取能有效降低淀粉、蛋白向提取液中遷移，而對于色素類雜質，石墨化炭黑填料是最有效的凈化手段。因此本文最終采用乙腈與水混合提取，加入氯化鈉鹽析離心后，取乙腈層經PestiCarb-SPE柱凈化，采用乙腈-苯(3∶1)洗脫，每2 mL分段接收，洗脫溶劑中苯的引入，有助于降低石墨化炭黑對含苯環結構農藥的吸附，2 mL乙腈上樣時，12種化合物均未流出。圖2給出了不同體積乙腈-苯(3∶1)洗脫時12種農藥在PestiCarb-SPE柱上的回收率，結果表明除芐嘧磺隆在4～14 mL、吡嘧磺隆在2～8 mL、戊菌唑在0～8 mL和咪鮮胺在2～16 mL流出之外，其余8種化合物均在0～4 mL流出。為保證回收率，同時考慮到基質引入后的影響，最終對蓮葉、蓮藕、蓮子肉、蓮子殼和田泥樣品，采取PestiCarb-SPE柱凈化，2 mL乙腈溶解上樣，20 mL乙腈-苯(3∶1)洗脫接收。

圖2 乙腈-苯(3∶1)不同體積下洗脫PestiCarb-SPE柱上12種農藥的回收率Fig.2 Elution recoveries of twelve pesticides in PestiCarb-SPE column by different volumes of acetonitrile-benzene(3∶1)

2.3 線性關系、儀器定量下限與基質效應

在“1.2”條件下進樣5 μL測定溶劑標準溶液和基質標準溶液樣品，每個濃度重復進樣3次，標準溶液的配制及標準曲線的考察步驟見“1.4”。實驗結果表明，在0.005～2.500 mg/L(噻蟲胺為0.010～2.500 mg/L)范圍內，可獲得12種農藥的溶劑標準曲線、基質標準曲線和相關系數(見表2)，相關系數(r2)均大于0.97，以標準曲線最低濃度(S/N>10)為儀器定量下限，可得除噻蟲胺的儀器定量下限為0.01 mg/L外，其余農藥均為0.005 mg/L。

以12種農藥在不同基質中的線性方程斜率與在乙腈-水溶劑中線性方程斜率的比值考察基質效應(ME)，結果見表2。在蓮葉(0.15≤MEs≤0.71)、蓮子殼(0.41≤MEs≤1.26)中基質減弱效應表現較強，在蓮藕(0.39≤MEs≤1.08)、蓮子肉(0.34≤MEs≤1.04)中基質減弱效應較小，尤其是色譜中較早流出的化合物，如噻蟲嗪(0.15≤MEs≤0.49)、噻蟲胺(0.34≤MEs≤0.58);相對而言,田泥(0.95≤MEs≤1.44)、田水(0.81≤MEs≤2.17)中未表現出基質效應或存在一定的基質增強效應。因此最終采用相應基質標準溶液進行定量分析。

表2 不同樣品中12種農藥的相關系數、基質效應、平均回收率及相對標準偏差Table 2 Correlation coefficients(r2),matrix effects(MEs),average recoveries(A.R.) and RSDs for twelve pesticides in different matrices

(續表2)

PesticideNo.Sample matrixr2MEsA.R./% *RSD/%LowMiddle HighLowMiddleHigh9Solvent0.993 4Lotus leaf0.994 50.69103±2.6105±5.6106±3.52.65.33.3Lotus root0.990 50.95116±14.299.0±7.684.6±10.312.27.712.2Lotus seed meat0.993 70.81104±7.7103±3.3103±2.87.43.22.7Lotus seed shell0.991 20.8790.3±3.391.2±1.894.3±3.33.61.93.5Mud0.998 71.1773.5±1.185.0±2.9104±2.71.53.42.6Field water0.992 21.0885.4±5.287.9±3.592.8±2.3a ,87.5±2.0b6.14.02.5a,2.2b10Solvent0.993 0Lotus leaf0.997 70.5081.9±5.588.7±5.293.1±2.86.75.93.0Lotus root0.992 80.9695.3±13.492.3±5.781.9±11.714.16.214.3Lotus seed meat0.991 90.7290.8±6.983.9±5.886.8±2.37.77.02.7Lotus seed shell0.992 30.7577.4±3.775.6±4.076.0±2.94.85.23.7Mud0.998 71.0538.1±2.738.7±3.555.7±3.97.19.16.9Field water0.991 91.1271.2±12.054.0±5.361.2±4.6a,57.8±5.2b16.99.77.5a ,9.1b11Solvent0.996 7Lotus leaf0.997 30.71102±13.1107±7.5105±7.212.97.16.8Lotus root0.991 01.04109±11.598.7±4.593.9±11.510.64.512.3Lotus seed meat0.995 40.94106±3.6103±2.6101±3.03.42.52.9Lotus seed shell0.987 50.98103±8.296.0±11.191.8±8.38.011.69.0Mud0.999 31.1393.9±8.496.6±6.399.2±1.89.06.51.8Field water0.989 41.0576.2±8.565.3±4.655.7±3.1a ,64.5±3.8b11.17.15.5a,5.9b12Solvent0.990 3Lotus leaf0.997 30.54107±3.5102±2.7107±2.63.32.72.4Lotus root0.998 20.6994.8±13.199.2±4.9101±11.213.84.911.1Lotus seed meat0.997 40.73102±6.5104±1.9105±2.66.31.92.5Lotus seed shell0.993 00.9392.9±4.293.2±2.094.1±1.54.52.21.6Mud0.999 41.1692.9±2.991.9±4.699.7±0.83.25.00.9Field water0.991 71.6383.0±2.487.7±3.893.4±1.6a ,85.8±3.5b2.94.31.7a ,4.1b

*spiked concentrations were 0.01,0.10 and 1.00 mg/kg for lotus leaf,lotus seed shell and lotus seed meat,0.005,0.05 and 0.50 mg/kg for lotus root and mud,and 0.1,1.0,10.0 μg/L(a) and 100.0 μg/L(b) for field water;pesticide No. were the same as that in Table 1

2.4 回收率、相對標準偏差與方法定量下限

按照“1.5”進行加標回收率試驗，12種農藥化合物在不同樣品基質中的平均回收率(A.R.)和相對標準偏差(RSD)結果見表2。結果表明：蓮葉中12種化合物的A.R.為81.9%～116%，RSD為1.5%～12.9%；蓮藕中12種化合物的A.R.為81.4%～116%，RSD為4.4%～25.1%；蓮子肉中12種化合物的A.R.為83.9%～107%，RSD為1.3%～14.8%；蓮子殼中12種化合物的A.R.為75.6%～103%，RSD為1.6%～11.6%；田泥中除咪鮮胺的A.R.為38.1%～55.7%(<60%)和RSD為6.9%～9.1%外，其余化合物的A.R.為64.6%～104%，RSD為0.9%～9.5%；田水中除噻蟲胺在低質量濃度(0.10 μg/L)無法檢出，咪鮮胺和茚蟲威在中、高加標水平下的A.R.為54.0%～65.3%(<70%)，RSD為5.5%～16.9%外，其余化合物和加標水平下A.R.為71.2%～101%，RSD為0.9%～16.9%。根據殘留試驗標準方法要求，以最低加標水平為方法定量下限(LOQ)，結果表明：田水中除噻蟲胺的LOQ為1.0 μg/L之外，其余均為0.1 μg/L，12種化合物在蓮藕、田泥中LOQ為0.005 mg/kg，在蓮葉、蓮子殼和蓮子肉中LOQ為0.01 mg/kg。

2.5 實際樣品的測定

3 結 論

為保證特色小宗作物蓮藕的生產和食用安全，本文通過采用乙腈-水混合提取，氯化鈉鹽析離心，分取乙腈提取液過PestiCarb固相萃取柱凈化洗脫，水樣采用C18固相萃取柱直接富集凈化洗脫，洗脫液濃縮定容后，超高效液相色譜-串聯質譜基質外標法定量測定，建立了蓮藕、蓮葉、蓮子肉、蓮子殼、田泥和田水中12種農藥殘留的分析方法，并用于田間殘留試驗實際樣本的測定。本方法符合殘留分析標準(RAQCG)的要求[10]，能夠滿足蓮葉、蓮藕等樣品中不同農藥殘留的檢測要求，并對其他農產品及環境樣本中12種農藥的檢測具有參考意義。