海風(fēng)藤總黃酮抗氧化應(yīng)激損傷作用研究

胡昱月

（河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院中藥科，河南 南陽(yáng) 473000）

心血管疾病發(fā)病率高，并發(fā)癥多［1］。目前研究表明主要與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂有關(guān)［2］。血管內(nèi)皮紊亂多與氧自由基引起的過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)［3］。由于中藥的多成分、多靶點(diǎn)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，研究熱點(diǎn)多從植物中尋找天然的抗氧化活性物質(zhì)。海風(fēng)藤為胡椒科植物風(fēng)藤Piper kadsura（Choisy）Ohwi的干燥藤莖，味辛、苦，性微溫，具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，止痹痛的功效［4］。現(xiàn)有研究表明海風(fēng)藤具有抗氧化作用［5］。本研究采用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，探討海風(fēng)藤總黃酮的抗氧化作用及其作用機(jī)制，總結(jié)如下。

1 材 料

細(xì)胞。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢）。

儀器。LT-CIX250FTCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱［立德泰勀（上海）科學(xué)儀器有限公司］，全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海拜格生物科技發(fā)展有限公司），MF53倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司），高速離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）。

藥物與試劑。海風(fēng)藤購(gòu)自張仲景大藥房，干燥后，稱取200.05g，95%乙醇80℃回流提取3次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至干燥，所得粉末為海風(fēng)藤總黃酮，得率為2.15%。MTT（武漢百浩天生物科技有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）測(cè)試盒（北京索萊寶科技有限公司）。內(nèi)皮素1（Endothelin 1，ET-1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）試劑盒、白細(xì)胞介素6（Interleukin6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒、白細(xì)胞介素8（Interleukin8，IL-8）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）。

2 方 法

海風(fēng)藤總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞，消化離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于96孔板中每孔100μL，24h后，分別加入終濃度為0.1、0.5、1、2、4mg/mL海風(fēng)藤總黃酮，陽(yáng)性組加入依達(dá)拉奉（10μmol/L），空白組和模型組加入等容量的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），孵育48h后，加入終濃度為1200μmol/L的過(guò)氧化氫，空白組加入PBS，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8h［6］，測(cè)定OD值，計(jì)算HUVECs細(xì)胞存活率。存活率=（各實(shí)驗(yàn)組OD值/正常對(duì)照組OD值）×100%。

SOD、MDA、NO含量測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞，消化離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，每孔接種2mL于12孔板中，貼壁后，分別加入終濃度0.5、1、2mg/mLh海風(fēng)藤總黃酮，陽(yáng)性組加入依達(dá)拉奉（10μmol/L），空白組和模型組加入等容量的PBS，孵育48h后，加入終濃度為1200μmol/L的過(guò)氧化氫，空白組加入PBS，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8h，收集細(xì)胞上清液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD、MDA、NO含量。

ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中ET-1、IL-6、IL-8含量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞，消化離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，每孔接種2mL于12孔板中，貼壁后，分別加入終濃度0.5、1、2mg/mL海風(fēng)藤總黃酮，陽(yáng)性組加入依達(dá)拉奉（10μmol/L），空白組和模型組加入等容量的PBS，孵育48h后，加入終濃度為1200μmol/L的過(guò)氧化氫，空白組加入PBS，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8h，收集細(xì)胞上清液每孔加入待測(cè)細(xì)胞上清液50μL；樣品孔中加入40μL樣品稀釋液和10μL樣品，空白孔除外；用封板膜封板后，37℃孵育反應(yīng)30min；洗滌，每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外；溫育、洗滌、顯色在450nm測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)樣品的OD值計(jì)算ET-1、IL-6、IL-8含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以（±s ）表示、用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

海風(fēng)藤總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫損傷HUVECs存活率的影響。如表1所示，過(guò)氧化氫的誘導(dǎo)損傷可導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞存活率降低，海風(fēng)藤總黃酮可顯著提高過(guò)氧化氫損傷HUVECs細(xì)胞的存活率，其中1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL組與模型組比較有顯著性差異，且4mg/mL組與2mg/mL比較存活率有所降低，所以后續(xù)試驗(yàn)僅研究0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL3個(gè)組的作用。

表1 海風(fēng)藤總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫損傷HUVECs存活率的影響 （±s）

表1 海風(fēng)藤總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫損傷HUVECs存活率的影響 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 給藥劑量 存活率/%空白組 100.00±0.00模型組 57.28±6.54*陽(yáng)性組 10μmol/L 79.32±8.13#海風(fēng)藤總黃酮 0.1mg/mL 56.34±5.15 0.5mg/mL 68.35±4.27#1mg/mL 77.31±5.34#2mg/mL 83.16±7.53#4mg/mL 78.23±7.39#

海風(fēng)藤總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫損傷HUVECs氧化應(yīng)激損傷SOD、NO、MDA的影響。如表2所示，與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞SOD、NO水平有顯著降低，MDA水平升高；海風(fēng)藤總黃酮作用后，與模型組比較海風(fēng)藤總黃酮0.5mg/mL組可顯著提高NO水平，降低MDA水平；海風(fēng)藤總黃酮1mg/mL、2mg/mL組可顯著提高SOD、NO水平，降低MDA水平。

表2 海風(fēng)藤總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫損傷HUVECs細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷SOD、NO、MDA的影響 （±s）

表2 海風(fēng)藤總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫損傷HUVECs細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷SOD、NO、MDA的影響 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

MDA（μmol/L）組別 給藥劑量 SOD（U·mL）NO（μmol/L）空白組 50.24±5.43 7.12±0.74 91.16±9.21模型組 30.78±3.65*27.38±1.53*56.33±6.15*陽(yáng)性組 10μmol/L45.52±5.11*#10.97±1.25*#78.32±7.53*#海風(fēng)藤總黃酮 0.5mg/mL 36.53±3.54*20.19±1.76*#66.37±6.82*#1mg/mL 42.45±4.51*#14.46±1.24*#71.74±6.85*#2mg/mL 46.35±3.96*#12.83±1.35*#73.69±7.73*#

海風(fēng)藤總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫損傷HUVECs氧化應(yīng)激損傷ET-1、IL-6、IL-8的影響。如表3所示，與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞ET-1、IL-6、IL-8水平有顯著升高；海風(fēng)藤總黃酮作用后，與模型組比較海風(fēng)藤總黃酮0.5mg/mL組可顯著降低ET-1、IL-6、IL-8水平；海風(fēng)藤總黃酮1mg/mL、2mg/mL組可顯著降低ET-1、IL-6、IL-8水平。

表3 海風(fēng)藤總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫損傷HUVECs細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷ET-1、IL-6、IL-8的影響 （±s）

表3 海風(fēng)藤總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫損傷HUVECs細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷ET-1、IL-6、IL-8的影響 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 給藥劑量 ET-1（ng/L） IL-6（ng/L） IL-8（ng/L）空白組 83.12±5.94# 24.39±1.12#406.52±12.34#模型組 122.46±4.89* 32.67±2.31*589.32±31.41*陽(yáng)性組 10μmol/L 95.38±3.54*# 26.51±1.82*#451.27±28.19*#海風(fēng)藤總黃酮 0.5mg/mL 119.26±4.35*#29.65±2.19*#499.37±18.79*#1mg/mL 108.65±3.63*#27.33±1.38*#472.41±22.33*#2mg/mL 95.92±2.58*# 26.44±2.06*#42.63±19.89*#

4 討 論

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化的平衡被打破，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)氧化損傷，造成細(xì)胞衰老、凋亡或死亡，為許多疾病的發(fā)病機(jī)制，與心血管損傷關(guān)系密切，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［7］。細(xì)胞內(nèi)的能量代謝和生物氧化主要在線粒體中進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加會(huì)導(dǎo)致氧化損傷，細(xì)胞內(nèi)的ROS主要來(lái)源于線粒體［8］。因此，抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激、抗氧化應(yīng)激損傷，對(duì)防治心血管疾病具有重要的臨床意義［9］。H2O2是一種活性氧，可透過(guò)細(xì)胞膜氧化細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，從而造成氧化損傷。

研究結(jié)果表明，H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷使HUVECs的存活率顯著降低；海風(fēng)藤總黃酮可顯著提高氧化應(yīng)激損傷HUVECs的存活率，SOD和MDA是判斷細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激的指標(biāo)，SOD是抑制過(guò)氧化物產(chǎn)生的重要的內(nèi)源性抗氧化酶，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物，可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用［10］。

海風(fēng)藤總黃酮作用后，可顯著改善由H2O2造成的細(xì)胞內(nèi)SOD水平下降，MDA水平升高的現(xiàn)象，SOD水平升高，MDA水平下降。ET-1是縮血管因子，內(nèi)皮受損后細(xì)胞內(nèi)ET-1合成增加，NO則相反，內(nèi)皮受損后合成降低。海風(fēng)藤總黃酮可降低ET-1水平，升高NO水平，起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

IL-6和IL-8是重要的炎癥因子，內(nèi)皮功能紊亂與其水平的升高密切相關(guān)，可通過(guò)直接作用或間接調(diào)節(jié)粘附分子表達(dá)來(lái)吸引炎癥細(xì)胞，本研究表明，海風(fēng)藤總黃酮可降低IL-6、IL-8水平。海風(fēng)藤總黃酮可保護(hù)由過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)SOD、MDA、ET-1、NO、IL-6、IL-8等氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)因子。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了海風(fēng)藤總黃酮較強(qiáng)的抗氧化作用，初步證實(shí)了其保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制。