微生物作用下碳鋼陰極保護氫滲透研究方法

劉相局，黃彥良

（1.中國科學院海洋研究所 海洋環境腐蝕與生物污損重點實驗室，山東 青島 266071；2.中國科學院大學，北京 100049；3.中國科學院海洋大科學研究中心，山東 青島 266071；4.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋腐蝕與防護開放工作室，山東 青島 266237）

氫鼓泡、氫致裂紋、氫致塑性損失（氫脆）、高 溫氫腐蝕、氫化物相的產生或氫致馬氏體相變等是碳鋼在制造和服役過程中最為常見的氫損傷形式[1]。目前，常用氫脆泛指以上氫損傷形式。陰極保護作為碳鋼在服役過程中最為常見的腐蝕防護方法之一，在其抑制碳鋼陽極溶解的同時，會促進析氫反應的發生，使碳鋼表面產生更多的氫原子，進而增加了碳鋼發生氫脆的可能性。研究表明，即使施加的陰極保護電位未達到析氫電位，材料表面沒有明顯的析氫現象，仍有氫進入金屬材料內部，使材料發生氫脆[2-3]。

微生物腐蝕是指附著在材料表面的生物膜中的微生物自身生命活動及其代謝產物直接或間接地加速材料腐蝕過程的現象。參與材料腐蝕的微生物多是環境中鐵硫循環的參與者。腐蝕微生物種類繁多，根據細菌種類及作用的不同，可以分為硫酸鹽還原菌SRB、硫氧化菌SOB、產酸菌APB、鐵氧化細菌IOB、鐵還原細菌IRB、硝酸鹽還原菌NRB以及產粘液細菌SFB等[4]。研究發現，對金屬材料施加陰極保護，會抑制其表面生物膜的附著和生長，進而抑制微生物腐蝕[5]。目前，對陰極保護抑制金屬腐蝕的研究主要集中在靜電作用力[6-8]、陰極氧還原反應[9-10]對生物膜的形成，以及陰極保護對已附著生物膜的影響[11]等方面。然而在研究陰極保護對微生物腐蝕抑制的過程中，往往會忽略陰極極化對材料氫脆的影響。Vigdorovich和Zavershinskii[12]研究了St3鋼在含有SRB和H2S的培養基中的氫滲透電流，發現氫滲透電流在有菌的培養基中比在無菌培養基中高2倍以上。Romero等[13]在研究利用氫滲透測試技術來表征金屬/生物膜界面上 SRB的生物活性時發現，該菌的存在明顯增加了金屬的氫滲透電流。Javaherdashti等[14]研究發現，SRB對3.5%NaCl溶液中碳鋼的氫致開裂有明顯的促進作用。因此，在對碳鋼施加陰極保護時，不僅要考慮氫脆等問題，還需要考慮到其所處服役環境中微生物對氫脆是否有協同作用。

1 微生物生長代謝的測定

微生物的生長和代謝是影響金屬腐蝕的重要因素之一。因此，在研究微生物對陰極保護作用下碳鋼氫滲透的影響前，首先要測定微生物的生長和代謝基本參數，如微生物生長曲線、代謝產物和對環境 pH的影響等。

1.1 微生物生長曲線的測定

1）分光光度法，也稱濁度法。該方法方便、快捷，可連續測定，是目前最為常用的測試方法。測試細菌濁度最常用的波長有480nm（藍光）、540nm（綠光）、600nm（橙光）和 660nm（紅光）[15]。濁度測試時，在較短的波長下靈敏度最好。對于細胞密集的懸液，在較長波長下準確度更高。濁度的單位為某波長下的光密度（Optical density，OD）。濁度測量的缺點是不能區分活菌和死菌，因此對于微生物衰亡期的測定不明顯。

2）活菌計數法，又稱平板菌落計數法，包括平板涂布法和傾倒平板法。其優點是可直接反映樣品中活菌數量，缺點是操作繁瑣。對于厭氧菌，可在厭氧手套箱內進行操作，或利用Hungate滾管技術，對細菌進行計數。

3）顯微計數法，即利用計數室（板）對微生物進行直接計數。其優點是操作簡單、迅速、成本低，且能直接觀察微生物細胞的大小以及形態特征。缺點是不能區分測定死活微生物的數目。

1.2 菌量測定

1）濁度與菌體數量之間的關系。對于單細胞生物，濁度在一定程度上和細胞數量成比例。可通過建立標準曲線，將細胞數量（活菌或顯微計數）、干重或蛋白質含量與濁度聯系起來。當細胞濃度過高時，測試濁度會低于理論值，此時可對菌懸液稀釋后再做測量。為保證測試結果的準確性，所測樣品的濁度應盡量保持在0.1～0.65之間。

2）三磷酸腺苷（ATP）法。該方法是Littman等[16]提出的，用于測定油田注水中 SRB的相對含量。其主要檢測步驟包括：取樣、樣品 ATP提取、添加熒光素-熒光素酶、測定生物發光值、計算ATP的濃度和活菌數量。其優點是靈敏、快速、簡便、穩定。缺點是熒光強度（RLU）和菌落形成單位（CFU）之間沒有直接關系[17]。

3）最大可能菌數法（The Most Probable Number,簡稱MPN法）。根據API RP-38，該方法采用以乳酸鈉為碳源的液體培養基，用以測定SRB的細菌數量。培養基具體成分見表1。

表1 MPN法培養基組成

4）其他方法。菌量的測定方法還有很多，如上所述的活菌計數法和顯微計數法不僅可以用于測定微生物的生長曲線，同樣可用于菌量的測定。其他方法還有電子計數器計數法、測定細胞質量法、測定細胞總氮量或總碳量法等。

微生物生長曲線及菌量測試方法各有優缺點，實驗人員應根據不同的測試精度要求、儀器設備、測試時間等因素，綜合考慮，選擇最適宜的測試方法。

1.3 其他參數的測定

1）pH值的測定。pH值是影響微生物腐蝕的重要因素之一，同樣也是影響陰極保護過程中碳鋼氫滲透的重要因素。特別是當周圍環境處于酸性狀態時，陰極保護會促進碳鋼表面氫的形成，加速氫脆的發生。

2）代謝產物的測定。微生物代謝產物具有多樣性，對氫滲透的影響也各不相同。SRB的代謝產物 H2S微溶于水后會產生 H2，造成氫脆[18-19]。F.Huang等[20]研究發現，H2S對 X65鋼的腐蝕產物FeS在基體表面附著，可阻礙其氫滲透。產酸菌如硝酸鹽及亞硝酸鹽氧化菌、硫桿菌屬、醋酸桿菌等能夠代謝產生乙酸、甲酸、H2NO3和 H2SO4等[4]。這些酸的存在會顯著降低周圍環境的pH值，使金屬發生腐蝕以及促進陰極保護過程中氫的產生，導致氫脆。

常用的微生物代謝產物檢測手段有氣相色譜法和高效液相色譜法等。若對精度要求較高，可將色譜和質譜聯用，使兩者優勢互補。例如氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）和高效液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-MS）。核磁共振技術（NMR）同樣也可用于高精度代謝產物分析。

2 氫滲透測量系統

2.1 試樣的選擇及測試前處理

氫滲透試樣可以是片狀或者管狀的。其尺寸應能用于分析基于一維擴散的瞬態滲透電流。根據ASTM G148—97[21]，片狀試樣暴露于電解質溶液的半徑與厚度比應大于10∶1，管狀試樣需根據平面擴散方程分析實驗結果，其外徑與內徑比值應小于 1∶1。考慮到原子氫從充氫面擴散至另一面所需的響應時間、氫滲透電流密度達到穩態擴散電流密度所需的時間以及長時間實驗導致試片被腐蝕等問題，還需要選擇具有合適厚度的試樣。

試樣在陽極池的一面常采用金屬鎳[22-23]或金屬鈀[24-25]作鍍層，以提供試樣表面原子氫被氧化的催化活性，并阻止金屬試樣表面發生腐蝕反應，增加測量結果的準確性[26]。幾種鍍層工藝條件見表2。

表2 常見鍍鎳/鍍鈀配方及工藝條件

2.2 Devanathan-Stachurski雙電解池及測試系統

氫滲透測試目前多采用Devanathan-Stachurski雙電解池技術[30]。以片狀試樣所適用裝置為例。如圖1所示，裝置由金屬試樣分成互不相通的左右兩室，分別為陰極池和陽極池。右側陽極池一般充入優級純的氫氧化鈉溶液，并對試樣 A面施加恒定的陽極極化電位。若陽極池填充0.1mol/L NaOH溶液，通過測定鍍鎳層在其中的鈍化區間（約為 0～+300 mV (vs.Hg/HgO)）[31]，可確定對陽極池施加的陽極極化電位，例如+300 mV (vs.Hg/HgO)的極化電位。當測得電流密度小于0.1 μA/cm2后，即可滿足背景電流要求[21]，可進行下一步氫滲透測試。將待測電解質溶液（例如含待測菌體的培養基、無菌培養基或其他溶液等）充入陰極池，對試樣C面施加陰極電位或電流，發生反應H++e→H0，產生的原子氫H0一部分復合成分子氫放出，另一部分通過表面吸附和擴散作用進入試樣內部。氫原子擴散至A面后，將在A面被氧化（H0→H++e）而產生陽極電流，利用恒電位儀將該電流記錄下來，減去背景電流后即為即時的氫滲透電流。

若待測電解質溶液為無菌/有菌培養基，則測試前須將裝置放入滅菌鍋內121℃滅菌20～25min，不能滅菌的裝置用75%酒精擦拭，并用紫外線滅菌燈照射滅菌30min。管狀試樣用Devanathan-Stachurski雙電解池模型如圖2所示。

3 結語

微生物在環境中無處不在，且具有生物多樣性和代謝產物多樣性。關于微生物的研究目前主要集中在其對金屬材料的腐蝕情況，而對于微生物、氫滲透和陰極保護三者之間關系的研究報道很少。在已有報道中可以看出，微生物的存在促進了陰極保護下金屬的氫滲透[19,23,29]，起抑制作用的微生物鮮有報道。因此，研究微生物作用下碳鋼陰極保護對氫滲透的影響對實際工程應用中陰極保護電位的選取具有重要的意義。