假交替單胞菌對EH40/B10電偶腐蝕的影響

高潔艷，吳佳佳，張盾

（1.中國科學院海洋研究所，山東 青島 266071；2.中國科學院海洋大科學研究中心，山東 青島266071；3.青島國家海洋科學與技術實驗室，山東 青島 266237；4.中國科學院大學，北京 100049）

在海洋工程設施中，往往多種金屬材料共同使用，電偶腐蝕難以避免[1,2]。由于海洋環境十分復雜，影響金屬材料電偶腐蝕的因素多種多樣，如海水的pH、溫度、溶解氧、流速、壓力等[2-6]。在這些影響因素中，微生物對金屬材料腐蝕的影響不容忽視[7-10]。據報道，微生物腐蝕所致腐蝕損失占總腐蝕損失的20%左右[11]。因此，為減少腐蝕造成的損失，對微生物腐蝕的研究刻不容緩。目前對于微生物腐蝕的研究多集中在微生物對單一金屬材料腐蝕的影響，微生物對電偶腐蝕影響的研究報道較少。Eashwar等[12]以天然海水為介質，研究了316不銹鋼為陰極，鎳、低碳鋼、鋅分別為陽極時的電偶腐蝕。結果顯示，以鎳為陽極時，陰極316不銹鋼上存在致密生物膜，鎳的腐蝕加速；但以低碳鋼和鋅為陽極時，以碳酸鈣和氫氧化鎂為主的鈣質沉積物在316不銹鋼上快速沉積，使得生物膜密度降低，減緩了陽極的腐蝕速率。Krogstad等[13]研究了鎳鋁銅合金與316L不銹鋼在天然海水中的電偶腐蝕，發現電偶電流在偶對浸泡6～10天后呈線性增長，直到穩定在12 μA/cm2，他們認為這是陰極不銹鋼表面的生物膜催化了陰極還原反應所導致的。Dexter等[14]以奧氏體不銹鋼為陰極，分別以銅、碳鋼、鋁為陽極時發現，在天然海水中覆蓋了生物膜的陰極比沒有覆蓋生物膜的陰極更加速了陽極的腐蝕。由此可見，目前微生物對電偶腐蝕影響的研究多集中在以不銹鋼為陰極的研究。

隨著船舶工業的高速發展，對高強度船板的需求也快速增加，EH40鋼就是常用的典型船用鋼之一[15]，而B10等鎳銅合金因為具有良好的耐蝕性，所以是艦船上常用的管路材料[16-19]。因此，擬以 EH40鋼和B10銅合金為對象，利用電化學方法、表面分析方法和環境參數測定等方法研究海洋假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp.，P.sp.）對 EH40/B10 電偶腐蝕的影響，從而揭示P.sp.對EH40/B10電偶腐蝕的影響機制。

1 實驗方法

1.1 實驗材料準備

實驗將 EH40鋼和 B10銅合金都加工成尺寸為10 mm×10 mm×3 mm的樣品，背面焊接銅導線后，預留出工作面（工作面積為1 cm2），其余部分全部用環氧樹脂密封起來。待環氧樹脂固化后，將樣品依次用240#、400#、800#的砂紙打磨，之后用蒸餾水沖洗，再經無水乙醇超聲清洗，冷風吹干。最后用錫紙緊密包裹后，在立式壓力蒸汽滅菌鍋中 121 ℃下高溫高壓滅菌20 min。

1.2 實驗介質

實驗以2216E 液體培養基（1 L海水中加入5 g胰蛋白胨、1 g酵母粉和0.01 g高磷酸鐵）為介質。實驗前，將配制好的2216E液體培養基在立式壓力蒸汽滅菌鍋中121 ℃下高溫高壓滅菌20 min，然后冷卻至室溫。在無菌對照體系中，直接以滅菌后的2216E液體培養基為實驗介質；在有菌體系中，以接入假交替單胞菌的2216E液體培養基為介質。將無菌和有菌體系都置于室溫環境中，并且對有菌體系每天更換1/2體積的新鮮培養基，以確保假交替單胞菌在實驗期間連續穩定生長。

1.3 電化學測試

利用 Gamry3000電化學工作站對樣品的電偶電位、電偶電流以及開路電位（OCP）進行測試，其中電偶電位和電偶電流的測試參照 GB/T 15748—2013《船用金屬材料電偶腐蝕試驗方法》[20]，電極間距為7 cm，面積比為1:1，平時用銅導線連接，測試時斷開連接。測試采用三電極體系，其中EH40和B10為工作電極，石墨電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極。

1.4 腐蝕形貌觀察和生物膜表征

使用掃描電子顯微鏡（SEM，JSM-6700F）對浸泡21天后的樣品進行腐蝕形貌觀察。無菌體系中的樣品取出后用氮氣吹干，有菌體系中的樣品取出后，先用體積分數為 2.5%的戊二醛溶液浸泡 1～2 h以固定微生物，之后依次使用體積分數為30%、50%、70%、90%、100%的無水乙醇浸泡脫水 15 min，最后進行干燥和噴金。去除腐蝕產物后的樣品經無水乙醇超聲清洗干燥后直接進行觀察。用于生物膜表征的樣品，在體積分數為 2.5%的戊二醛溶液中浸泡 1～2 h后使用磷酸鹽緩沖液（PBS）進行漂洗，然后浸入加有DAPI（5 mg/L）和 ConA-Texas Red（200 mg/L，與多糖結合）的PBS溶液中染色15 min。取出試樣后用 0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液清洗，之后浸泡入加有FITC（0.001%，與蛋白質結合）的碳酸氫鈉溶液中染色15 min。最后將試樣取出用PBS漂洗去除未結合的染料，用于激光共聚焦顯微鏡（CLSM，LSM 710）觀察。

1.5 環境參數測定

對有菌體系中的 P.sp.用 2216E固體培養基平板計數法進行定量。對兩種體系的溶解氧濃度（DO）和pH分別使用溶解氧儀（Thermo Orion 5-star）和pH 計（PHS-3C）進行測定。

2 實驗結果

2.1 電化學結果

由圖1可以看出，無菌和有菌體系中EH40/B10電偶對在浸泡初期，電偶電位都迅速負移，后逐漸趨于穩定，最后無菌體系中電偶電位穩定在-415 mV左右，有菌體系電偶電位穩定在-480 mV左右，有菌體系的電偶電位比無菌體系負移了65 mV左右。由圖2可以看出，由于電偶對在剛浸入無菌或有菌溶液的第一天反應活性較大，無菌和有菌體系中的電偶電流都隨時間迅速減小。隨后無菌體系中的電偶電流在10～15 μA/cm2范圍內波動變化，有菌體系電偶電流則在 0.05～0.2 μA/cm2范圍內波動變化，二者相差近百倍。說明EH40/B10電偶對在無菌體系中的電偶腐蝕速率遠大于在有菌體系中的電偶腐蝕速率，即無菌體系中 EH40的陽極溶解速率要遠大于有菌體系中EH40的陽極溶解速率。

為了進一步研究P.sp.對EH40/B10電偶腐蝕的影響，實驗還分別測試了無菌和有菌條件下各金屬電極的開路電位。由圖3可以看出，無論EH40和B10是否偶接，無菌體系中EH40和B10的開路電位都分別比有菌體系中EH40和B10的開路電位要正。

兩種體系中未偶接 EH40、B10的開路電位以及電偶電位如圖4所示。可以看出，無菌體系中，電偶電位靠近EH40的自腐蝕電位；有菌體系中，電偶電位幾乎與EH40的自腐蝕電位重合。說明在有菌條件下，偶對中EH40的腐蝕情況可以看作是發生了自腐蝕，因而電偶腐蝕效應不明顯。

無菌和有菌體系中，偶接斷開后，B10與EH40的開路電位之差（電偶腐蝕的理論驅動電壓）隨時間的變化如圖5所示。可以看出，雖然剛浸入溶液時，可能由于電極表面反應活性高，以及有菌體系的氧含量還較高，無菌體系的電位差小于有菌體系。1天之后，無菌體系中的電位差明顯大于有菌體系，無菌體系的電位差隨浸泡時間延長逐漸增大，最后穩定在200 mV左右，有菌體系的電位差隨時間逐漸減小，最后穩定在30 mV左右。由此可見，體系達到穩定后EH40/B10偶對在無菌體系中發生電偶腐蝕的理論驅動電壓比在有菌體系大170 mV左右，說明EH40/B10偶對在無菌體系中比在有菌體系中有更大的電偶腐蝕傾向。這與圖2中無菌體系中電偶電流更大的結果是一致的，說明在含有 P.sp.的有菌體系中電偶腐蝕受到了抑制。

2.2 腐蝕形貌觀察

EH40分別在無菌和有菌體系中浸泡 21天去除腐蝕產物前后的SEM圖如圖6所示。可以看出，無菌體系中偶接和未偶接的EH40表面都覆蓋了大量的腐蝕產物，而有菌體系中腐蝕產物則相對較少，覆蓋了一層致密的桿狀細菌，也就是 P.sp.。去除腐蝕產物后可以明顯看到，無論EH40是否偶接，無菌體系中的EH40都要比有菌體系腐蝕嚴重。B10分別在無菌和有菌體系中浸泡21天去除腐蝕產物前后的SEM圖如圖7所示。可以看出，無菌體系中未偶接的B10比偶接腐蝕得更嚴重，而有菌體系中偶接與未偶接的B10腐蝕情況幾乎相同。利用CLSM對有菌體系中浸泡21天后電極表面的生物膜表征結果如圖8所示，可以看出，無論是否偶接，EH40和B10表面都覆蓋了一層致密的生物膜，且EH40表面的生物膜比B10表面的生物膜相對更加致密。

2.3 環境參數分析

從圖9可看出，由于P.sp.剛接入體系6 h時，還處于快速生長繁殖的階段，所以數量較少，之后數量基本維持在105～107cfu/mL。由圖10和圖11可知，無菌體系中溶解氧的含量始終在7 mg/L附近波動變化，pH也始終維持在7.5左右；而有菌體系中6 h時溶解氧含量在6 mg/L左右，之后由于P.sp.大量繁殖，新陳代謝消耗氧氣，體系中的溶解氧含量迅速下降，3天后基本穩定在1 mg/L左右。由此推斷P.sp.可通過新陳代謝消耗氧氣來抑制電偶腐蝕。同時，有菌體系中pH的變化與溶解氧含量的變化基本一致，說明P.sp.的生命活動使得溶液pH降低，偏酸性。

3 分析與討論

將浸入無菌或有菌2216E液體培養基中的EH40和B10用銅導線連接，形成短路原電池。由圖4可知，無論是在無菌體系還是有菌體系中，EH40的自腐蝕電位均低于B10，因此在EH40/B10電偶對中，EH40一方面發生自腐蝕，另一方面與B10偶接后作為陽極加速溶解，而B10作為陰極受到保護。在不考慮溶液中含有Cu2+的情況下，EH40/B10腐蝕原電池的陰、陽極的反應分別為：O2+2H2O+4e→4OH-，Fe → Fe2++ 2e。

在有菌體系中，因為每天測試結束后更換1/2體積的新鮮培養基，所以 P.sp.的數量一直維持在較高的水平，但是由于 P.sp.通過呼吸作用不斷消耗體系中的氧氣，致使有菌體系中溶解氧濃度遠低于無菌體系中的溶解氧濃度。由此說明了相比于無菌體系，有菌體系中去極化劑氧的陰極還原反應速率受到了限制，進而抑制了陽極反應。因此，有菌體系中的電偶電流遠遠小于無菌體系，即有菌體系的電偶腐蝕速率遠小于無菌體系。

與此同時，對于單一金屬而言，當溶解氧濃度較低時，溶解氧作為去極化劑使陰極極化程度增加，從而導致金屬的自腐蝕電位負移。因此有菌體系中未偶接或者偶接斷開后EH40的開路電位都要比無菌體系偏負，同樣有菌體系中未偶接或者偶接斷開后 B10的開路電位也都要比無菌體系偏負。EH40和B10的開路電位在有菌體系中的負移程度不一樣，有菌體系中偶接斷開后 B10開路電位的負移程度要大于EH40。由圖 5可知，有菌體系中電偶腐蝕的理論驅動電壓遠小于無菌體系，由此進一步說明了有菌體系的電偶腐蝕傾向遠小于無菌體系。

進一步根據浸泡21天后電極的腐蝕形貌可以看出，在無菌體系中，雖然未偶接和偶接的EH40腐蝕形貌接近，但偶接B10比未偶接B10腐蝕得更輕，說明在無菌體系中偶接B10受到了陰極保護。在有菌體系中，無論是否偶接，EH40和B10表面都形成了一層致密的生物膜，并且有菌體系中EH40偶接與未偶接的腐蝕形貌比較接近，B10偶接與未偶接腐蝕形貌也比較接近。這進一步說明了在有菌體系中 EH40的電偶腐蝕效應不明顯，可以看作發生自腐蝕，這與圖4有菌體系中的電偶電位幾乎與EH40的自腐蝕電位重合的結果一致。綜上可知，含有 P.sp.的有菌體系中，電偶腐蝕受到了抑制，雖然 P.sp.的生命活動使溶液pH降低，但其對腐蝕的促進作用要小于保護性生物膜和呼吸耗氧對腐蝕的抑制作用。

4 結論

1）EH40/B10在無菌體系中的電偶腐蝕速率遠大于在有菌體系，主要是因為 P.sp.呼吸作用消耗氧氣以及在電極表面形成生物膜，從而抑制了電偶腐蝕。

2）在無菌體系中，偶接B10受到了陰極保護，比未偶接的B10腐蝕得輕；而在有菌體系中，是否偶接對EH40和B10的腐蝕影響不大，電偶腐蝕效應不明顯。