嗜水氣單胞菌滅活疫苗制備及其血清凝集抗體檢測

■ 陳昌福 曹麗敏 陳 輝 方蘋

（1 華中農業大學 武漢 430070；2 沈陽元豐飼料有限公司 沈陽遼中 110202；3 江蘇省漁業技術推廣中心 南京 210029）

從遼寧省沈陽市遼中區及其周邊患細菌性敗血癥的草魚（Ctenopharyngodon idellus）體內分離到嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的大量致病菌株中，選取毒力較強的菌株，制備成福爾馬林滅活菌苗后，接種健康草魚并收集其免疫血清。用血凝板法測定了免疫血清中對各分離菌株的凝集抗體效價，比較分析了分離菌株之間的抗原性（antigenicity）差異。結果表明，用6個菌株制備的滅活菌苗接種草魚后，均可以誘導受免草魚的血清中產生較高的凝集抗體效價，說明制備的滅活菌苗具有比較高的抗原性；免疫血清與各個分離菌株制備的滅活菌苗反應，出現的凝集效價高達512～2,048之間，說明用不同菌株制備的滅活菌苗上，存在能誘導草魚產生凝集抗體的大量共同抗原。

我國發展水產養殖業的地域遼闊，在不同地方的同種致病病原生物是可能存在不同血清型的。如果將從某一個地方分離的某種致病病原生物制備的疫苗，應用到全國所有水產養殖區域時，就有可能由于致病病原生物血型抗原等的不同，導致實施免疫接種后的動物因為不能獲得特異性免疫防御能力而導致免疫失敗。因此，在我國選擇某種致病病原生物的一個毒株制備成某種滅活疫苗，在全國范圍內應用是難以取得一致良好免疫效果的，而是有必要根據各地致病病原生物的血清型等抗原性特點，制備適合在當地使用的所謂“自家疫苗（autogenous vaccine）”。

我們已經從遼寧省沈陽市遼中區及其周邊養殖草魚（Ctenopharyngodon idellus）體內，分離到對草魚具有致病性的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）多株。為了研制預防有這種致病菌引起草魚細菌性敗血癥，本研究從大量分離菌株中選取毒力較強的菌株，制備成福爾馬林滅活菌苗后，接種健康草魚并收集免疫血清，通過血凝板測定各分離菌株的凝集抗體效價，比較研究了分離菌株的抗原性（antigenicity）差異。現將結果報告如下：

1 材料與方法

1.1 致病菌培養

將從患病草魚體內分離的A.hydrophila，并且通過人工感染毒力試驗證明對健康草魚具有較強毒力的LCG180626（1）、LCS180626（2）、LCP180626（3）、LCS180626（5）、LCG180626（6）和LCS180626（7）等6個菌株[3]，分別將其接種在BHIA（Diffco）培養基中，置于25℃恒溫培養箱中培養48 h，以滅菌生理鹽水洗下菌落并以3,500r/min離心，再用滅菌生理鹽水清洗3次后集菌，采用滅菌生理鹽水將菌液濃度稀釋至107cells/mL后，作為接種草魚的免疫原（immunogen）和進行免疫血清凝集效價測定的反應原（reactogen）。

而將LCG180501（1）、LCS180501（2）、LCP180501（3）、LCP180510（3）、LCG180510（4）、XCG180524（1）、LCP180616（1）、LCG180616（1）、LCG180618（1）、LCP180618（1）、LCS180618（1）、XCP180625（1）、XCG180625（1）、LCS180626（1）、LCG180626（3）、LCG180626（5）、LCG180626（7）、LCP180701（1）、LCG180721（1）、LCP180721（1）、LCS180527（1）、LCG180527（1）、LCP180527（1）等23個菌株，經過上述同樣的方法培養、滅活處理后，僅用作測定免疫血清中凝集效價的反應原。

1.2 免疫原的制備

在制備的A.hydrophila菌液中定量添加0.02%的福爾馬林，放置與28.0℃恒溫培養箱中，放置24h后進行滅活后，即為福爾馬林滅活A.hydrophila菌液。取滅活后的菌液100.0μL，分別接種在培養皿中，置于28.0℃恒溫培養箱中，放置24h后進行觀察，培養皿中無菌落長出，即證明菌體已經被徹底滅活，可以作為A.hydrophila滅活菌苗（免疫原和反應原）使用。

1.3 免疫接種

對每尾平均體重100.0g的健康草魚，經胸鰭基部注射0.25mL滅活A.hydrophila菌苗后，每個菌株的滅活菌苗接種20尾草魚，將免疫接種后的草魚放回水族中，采用經過曝氣自來水充氣飼養，每天分早、晚各投喂1次由沈陽元豐飼料有限公司生產的草魚人工配合飼料。飼養期間，水族箱中的水溫變化在24～30℃之間。

1.4 采血

自免疫接種滅活A.hydrophila菌苗后，將供試魚在水族箱中飼養28d后，從每一個試驗和對照組水族箱中隨機撈取6尾草魚，采用注射器刺穿尾動脈和切斷腹主動脈的方法采血，采集的血液盛裝在玻璃試管中，首先在室溫下放置2.0h，待其血液凝固后將盛血液試管移放入4.0℃冰箱中過夜，讓凝血塊進一步收縮后，分離免疫血清。

表1 受免草魚血清中凝集和交叉凝集抗體效價的變化

1.5 抗體效價的測定

免疫血清中凝集效價的測定采用血凝板法進行。用于凝集反應的反應原除了用作本研究中免疫原的A.hydrophila的6個菌株的滅活菌苗外，還有從患病草魚中分離的A.hydrophila，并經過福爾馬林滅活的另外23個菌株制備的滅活菌體。

2 結果

健康草魚在免疫接種6個菌株制備的福爾馬林滅活A.hydrophila疫苗后，血清中凝集抗體效價的變化的測定結果見表1所示。由表1可以看出，每個菌株的滅活菌苗（免疫原）均可以誘導受免草魚血清中產生較高的凝集抗體效價，這種結果說明A.hydrophila滅活菌苗具有比較高的抗原性。將A.hydrophila的6個菌株制備的免疫原，免疫接種草魚產生的免疫血清，與各個菌株制備的反應原凝集反應后，對不同菌株的反應原呈現的凝集效價高達512～2,048之間，這種結果說明用不同菌株制備的滅活菌苗上，存在能誘導草魚產生凝集抗體的大量共同抗原。尤其是LCS180626（2）、LCP180626（3）、LCS180626（5）和LCS180626（7）等4個菌株上，似乎與各個菌株均存在比較多的共同抗原。

3 討論

在世界范圍內，我國是水產養殖業發展大國。在養殖水生動物過程中，由各種細菌和病毒引起的暴發性疾病比較多見。為了預防各種疾病對水產養殖業造成的巨大損失，對養殖水生動物實施免疫預防，已經被證明是有效的途徑之一[4]。

由于我國發展水產養殖業的地域遼闊，在不同地方的同種致病病原生物是可能存在不同血清型的。因此，采用從某一個地方分離的致病病原生物（種毒）開發的商品化魚用疫苗，往往難以在全國不同養殖區域獲得同樣理想的免疫防御效果。因此，有必要根據各地致病病原生物的血清型等特點研制自家疫苗，以滿足免疫防控養殖水生動物疾病的需求[1]。

漁用自家疫苗的制備菌株是來源于疫苗應用地發病魚群，從當地發病魚體內分離鑒定致病菌后，經大量培養致病菌株制備自家疫苗。因此，其抗原成分基本包括了引起當地魚群疾病的病原，比較全面的抗原可能在一定程度上對接種魚群產生全面多方誘導，達到預防和控制疾病的目的。能有效地避免因不同的地區有不同的血清型病原菌存在，而因為不同血清型之間的抗原交叉保護力較弱，因而難以獲得一種覆蓋所有血清型的滅活疫苗的問題。

在本研究中，用A.hydrophila的6個菌株制備的滅活菌苗接種草魚后，證明每個菌株制備的滅活菌苗均可以誘導受免草魚的血清中產生較高的凝集抗體效價，證明了滅活菌苗均具有比較強的抗原性。從受免草魚獲得的免疫血清與從遼寧省遼中養殖區域收集的多個菌株制備的滅活菌苗進行凝集反應，均出現比較高的凝集抗體效價，證明了用不同菌株制備的滅活菌苗上存在能誘導草魚產生凝集抗體的大量共同抗原。在6個制備滅活疫苗的菌株中，除LCG180626（1）和LCG180626（6）等2個菌株外，接種LCS180626（2）、LCP180626（3）LCS180626（5）和LCS180626（7）等4個菌株后，獲得的受免草魚血清中，幾乎對所有作為反應原的菌株滅活菌苗，均可以產生比較高的凝集抗體效價。這個結果預示著如果采用這些菌株作為自家疫苗的出發菌株，就可能使受免草魚獲得對細菌性敗血癥比較強的免疫保護力。（參考文獻略）