川西北不同沙化程度草地土壤細菌群落特征

楊秉珣, 劉 泉, 董廷旭

(四川綿陽師范學院 資源環境工程學院, 四川 綿陽621000)

微生物是土壤生態系統的重要組成部分，微生物參與碳、氮循環，有機化合物分解以及能量傳輸、運送等多種過程的維護和調節，是土壤生態系統中最具有生命活力的重要組成部分[1-2]。微生物群落多樣性與土壤生態系統的結構、功能密切相關，在維持土壤肥力和土壤生態平衡中發揮著重要作用，其結構和功能對于周圍環境條件特別敏感，是土壤變化的重要指示之一[3]。細菌作為微生物中含量最多、豐富度最高的類群，通常占土壤微生物的70%～90%，具有最為豐富的遺傳多樣性，能有效促進有機質分解、營養物質的釋放，參與碳、氮等物質循環過程，維持了生態系統能量流動和物質循環[4-6]。在陸生系統中，細菌利用生產者提供的有機物質和代謝物作為營養來源，分解為簡單的無機物，同時這些無機物又是生產者的營養來源。土壤中細菌多樣性變化會影響土壤生態過程，例如養分循環等[7-8]。此外，土壤中細菌多樣性變化還會受自然和人為因素的影響，例如植被、土壤養分、土地利用方式等。高通量測序作為第二代測序方法，由于無需構建克隆，耗時少，通量高，能夠準確全面地反映土壤微生物群落分布特征等優勢，已經逐漸取代傳統的測序方法[9]。

自20世紀90年代以來，隨著我國實施的大規模生態恢復工程，西北地區土地沙化和荒漠化得到遏制，然而從目前的研究成果來看，我國土地沙化的重點工作仍集中在北方干旱、半干旱區域，忽略了對西北地區草地沙化的研究[10]。川西北高寒草原是全國五大牧區之一，地處青藏高原東緣，生態地理位置極其重要，是四川省沙化最嚴重的區域，過去20(1994—2013年)年間沙化總面積增加了28.1%，目前草地面積剩余820萬hm2。隨著全球氣候變化和人類掠奪式發展(濫墾和亂挖)，導致該區草原植被數量級覆蓋度急劇下降，生態環境也極度惡化，退化沙化草地面積也逐年擴大，形成了不同沙化程度的草地類型，這已經嚴重影響了該區經濟的可持續發展和生態安全問題，因此對該區不同沙化程度草地的治理和研究已經迫在眉睫[11-12]。截止目前，該區沙化草地的研究大部分集中在如何治理及治理措施的選取等方面，在沙化草地退化過程中土壤養分急劇降低，導致微生物功能降低。大量的研究也表明，草地沙化降低了土壤微生物數量和活性，不同沙化程度對土壤微生物群落的影響不同，微生物種類及多寡是土壤質量的重要指標，它們對環境極為敏感，又是恢復環境的先鋒，提高了生態系統的緩沖能力，微生物指標已經用來評價退化生態系統中生物群系與恢復功能之間的聯系并能為退化土壤恢復提供有用信息[11-12]。目前針對不同程度沙化草地土壤微生物群落特征多樣性的具體變化情況尚不明確。鑒于此，本文以典型川西北不同沙化程度草地為研究對象，運用高通量測序技術，研究土壤細菌多樣性、物種組成和豐富度，并結合土壤理養分探討影響細菌群落結構的環境因素，對發揮土壤潛在肥力、了解土壤健康狀況，實現該區植被的管理與可持續利用有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區域位于紅原縣(四川省西北部)，地處阿壩藏族羌族自治州中部(31°51′—33°19′N，101°51′—103°23′E)，屬于川西北高原灌叢和若爾蓋高原植被地區中的植被小區。該區屬高原寒冷地區，沙漠化土地總面積為6 915.4 hm2，海拔3 210～4 857 m，冬季長春秋季短，無夏季，日照充足，寒冷干燥，無霜期40～60 d，晝夜溫差大，年平均氣溫1.1℃，年均降水量753.0 mm，近十年極端最高氣溫為26℃，極端最低氣溫為-36℃，日照達2 417.9 h，日照率為55%。植被以亞高山草甸為主，沼澤植被占有優勢，受高寒氣候的影響，該區域以高山草甸土、亞高山草甸土和沼澤土為主，伴有寒漠土和風沙土，近年來風沙土的范圍不斷擴大。本研究的取樣點分布于紅原至若爾蓋公路旁，該區域不同沙化草地均有所表現。

1.2 試驗設計

2017年8—10月，對研究區進行初步的資料收集和調查，了解研究區沙化土地分布格局，采樣時間為植被生長最旺盛期，根據研究區現狀選擇不同沙化程度的草地(未沙化草地、輕度沙化草地、中度沙化草地、嚴重沙化草地)。GPS采集樣地經緯度和高程信息，詳細記錄樣地基礎環境和物種等指標(表1)。每種沙化草地分別選取3個500 m×500 m的樣地，每個樣地隨機選取1 m×1 m樣方15個，進行植物群落樣方調查。在每個樣方按照五點取樣法收取500 g左右鮮土，鮮土過2 mm篩除去大的礫石和根系，取樣深度為0—10 cm混合土樣(除去表層的枯落物和較多的根系)，充分混勻后液氮保存(-80℃)，帶回實驗室內用于測定微生物多樣性；另一部分自然風干15 d后過80目篩后測定土壤養分含量。

表1 不同程度沙化樣地特征

注：表中用1代表上坡位，2代表中坡位，3代表下坡位。坡向是順時針旋轉的角度來表示(以朝東為起點，為0°)，每45°為一個等級，其變化范圍在0～8之間，數字越大，表示越干熱[19-20]。

1.3 土壤樣品的測定

1.3.1 土壤養分的測定 一部分土壤樣品經自然風干20 d后，去除植物根系等雜物過2 mm篩。土壤pH值采用電極電位法(2.5∶1水土比浸提液)；有機碳和全氮含量采用元素分析儀；速效磷采用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法；堿解氮采用NaOH-H3BO3法；全鉀采用乙酸銨浸提—火焰光度計法[13]。

1.3.2 土壤細菌測序

(1) 土壤DNA提取和測序。土壤DNA的提取使用上海美吉公司提供的DNA試劑盒(Omega Bio-tek,Inc，Doravilla，GA，USA)利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行基因組DNA的檢測抽提。參照電泳初步定量的結果，使用Promega 公司的QuantiFluorTM-ST 藍色熒光系統對PCR 產物進行定量檢測，之后根據每個樣本的測序量要求進行相應比例的混合。利用磁珠純化后的PCR產物對目的片段(16 SrRNA V3—V4)進行檢測。采用上海美吉生物公司提供的MiSeq測序平臺，利用細菌的特異性引物(338 F_806 R)進行16 SrRNA基因擴增，使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。下機的原始數據去接頭、去污染、去低質量，篩選得到可信數據，根據索引號對比至各個樣品。

(2) 序列的優化及去雜。高通量測序過程中通常會出現一些點突變和高分子均聚物等測序錯誤，隨著測序長度的增加造成序列末端的質量降低，為了得到更高質量及更精準的生物信息分析結果，則應對有效序列進行去雜和修剪得到優化數據。使用軟件Trimmomatic，FLSAH對數據進行去雜。

(3) 生物信息分析及數據處理。根據Barcode 序列拆分各樣品數據，然后截取Barcode和引物的序列使用FLASH對進行拼接；高通量序列數據使用QⅡME進行數據處理：利用UPARSE軟件對全部有效序列進行聚類，默認以99%序列相似度對序列聚類獲得OTUs(operational taxonomic units，操作分類單元)；從每個OTUs選取一個代表性序列，以Greengenes數據庫為參考，使用RDP Classifier對OUT進行物種注釋，置信水平為80%；最后對樣品數據均一化處理，以樣品中數量最少的為標準，統一抽取有效序列來研究細菌群落結構。通過計算物種豐富度(OTUs)和土壤細菌群落多樣性。

計算細菌豐度(Community richness)的指數如下[14]：Chao指數是用Chao1算法估計群落中含OTU數目的指數，Chao1在生態學中常用來估計物種總數，由Chao最早提出。Ace指數用來估計群落中含有OTU數目的指數，由Chao提出，是生態學中估計物種總數的常用指數之一，與Chao1的算法不同。

細菌多樣性(community diversity)的指數如下[15]：Simpson指數用來估算樣品中微生物的多樣性指數之一，由Simpson提出，在生態學中常用來定量描述一個區域的生物多樣性，Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低。Shannon用來估算樣品中微生物的多樣性指數之一。它與Simpson多樣性指數均為常用來反映α多樣性的指數，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。

測序深度指數如下[16]：Coverage是指各樣品文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低。該指數反映了本次測序結果是否代表樣本的真實情況。對OTU列表中獲得的分類信息與豐度進行整理，在門和綱分類水平下對各樣品進行物種豐度統計及冗余分析(RDA)，可得到樣品中群落組成結構、相似性以及群落結構與環境因子的關系。

2 結果與分析

2.1 不同沙化草地土壤養分特征

由表2可知，川西北不同沙化草地土壤養分具有明顯差異，依次表現為：隨著沙化程度的增加，土壤pH值逐漸增加，而土壤有機碳、全氮、全鉀、堿解氮和速效磷逐漸降低；其中土壤pH值變化范圍7.56～8.63，均值為8.03，沙化草地pH值顯著高于未沙化草地(p<0.05)；土壤有機碳變化范圍為9.04～13.2 g/kg，均值為11.25 g/kg，ND和LD差異不顯著(p>0.05)，MD和HD差異不顯著(p>0.05)；土壤全氮變化范圍為1.01～1.23 g/kg，均值為1.11 g/kg，其中沙化草地土壤全氮顯著高于未沙化草地(p<0.05)，MD和HD差異不顯著(p>0.05)；土壤全鉀變化范圍為9.87～13.56 g/kg，均值為11.76 g/kg，ND和LD差民不顯著(p>0.05)，HD顯著高于其他草地(p<0.05)；土壤堿解氮變化范圍18.74～29.85 mg/kg，均值為24.24 mg/kg，不同草地土壤堿解氮差異均顯著(p<0.05)；土壤速效磷變化范圍18.74～29.85 mg/kg，均值為29.19 mg/kg，不同草地土壤速效磷差異均顯著(p<0.05)。

表2 不同沙化草地土壤養分特征

注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，下同。

2.2 不同沙化草地土壤細菌多樣性

如表3所示，所有樣品的平均覆蓋率為98%，表明該測序效果理想。在3%分類水平下，不同沙化草地土壤細菌Chao，Ace、Simpson指數、Shannon指數、OTU數量有所差異。OUT數目、Chao指數、Ace指數、Shannon指數均表現為：ND>LD>MD>HD，其中不同沙化草地土壤細菌覆蓋率和Simpson指數差異不顯著(p>0.05)；不同沙化草地土壤Chao、Ace、Simpson指數、Shannon指數、OTU均顯著高于未沙化草地。

表3 不同沙化草地土壤細菌序列統計及多樣性指數

2.3 不同沙化草地土壤細菌的群落組成特征

高通量測序結果顯示不同沙化程度草地土壤樣品中共檢測到細菌的32個門，65個綱，169個目。所有樣品一共獲得756 234條有效序列，其中最少序列為65 231條，最多序列為70 218條。這些序列的99.1%可以分類到不同的細菌門類，0.9%與數據庫比對分類到古菌門類。如圖1A所示，通過MiSeq高通量測序發現不同沙化草地土壤中檢測到的主要門有：變形菌門(Proteobacteria)(29.8%～35.2%)、放線菌門(Actinobacteria)(11.3%～19.8%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(11.3%～19.8%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(8.3%～12.6%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(3.2%～7.5%)、厚壁菌門(Firmicutes)(3.2%～7.2%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(1.6%～4.1%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(1.2%～3.9%)共8個門。其中，前6個門在土壤中占主導地位，約占到所有細菌的89%～95%。此外還發現了相對豐度小于1%的其他41個稀有門類，它們占總序列5.4%。

如圖1B所示，通過MiSeq高通量測序發現不同沙化草地下土壤中檢測到的主要綱有：α-變形菌綱(α-Proteobacteria)(21.9%～26.9%)、放線菌綱(Actinobacteria)(18.3%～29.3%)、酸桿菌綱(Acidobacteria)(15.3%～20.5%)、β-變形菌綱(β-Proteobacteria)(12.1%～13.5%)、嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)(6.3%～9.8%)、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)(5.4%～8.3%)、桿菌綱(Bacilli)(2.3%～7.2%)和δ-變形菌綱(δ-Proteobacteria)(1.7%～4.5%)共8個。其中，前6個綱在土壤中占主導地位，約占到所有所有綱的89%～95%。

圖1 不同沙化草地土壤細菌門和綱分類水平下的相對豐度

2.4 土壤養分與細菌群落結構的相關性

土壤可以提供細菌群落生長繁殖的微環境，而不同的植被類型通過改變土壤的微環境間接影響了土壤細菌群落結構的組成。土壤理化性質和細菌群落結構的相關性采用Mantel檢驗方法(Mantel tests)分析，從表4可以看出土壤細菌群落結構與土壤pH值、土壤含水量、土壤有機碳和總氮呈現顯著相關(p<0.05)。相關性分析表明，Proteobacteria，Acidobacteria，Firmicutes，Nitrospirae的相對豐富度與土壤pH值呈顯著負相關，Actinobacteria的相對豐富度與土壤pH值呈顯著正相關；Actinobacteria的相對豐富度與SOC呈顯著負相關，Proteobacteria，Acidobacteria，Chloroflexi，Firmicutes的相對豐富度與SOC呈顯著正相關；Actinobacteria的相對豐富度與TN呈顯著負相關，Proteobacteria，Acidobacteria，ChloroflexiFirmicutes的相對豐富度與TN呈顯著正相關；Chloroflexi的相對豐富度與TK呈顯著正相關；Chloroflexi，Gemmatimonadetes的相對豐富度與AN呈顯著正相關；Acidobacteria的相對豐富度與AP呈顯著正相關。

表4 土壤養分與土壤優勢細菌相對豐度相關性

注：*，**分別表示在0.05，0.01水平上差異顯著。

2.5 環境因素對微生物群落的影響

為了探討土壤環境對微生物群落組成的影響，本文通過將土壤理化性質分別與綱和屬分類水平下細菌的群落組成關系進行冗余分析，利用R語言bioENV篩選出最能體現土壤細菌群落結構變化的6個土壤因子，研究結果與Mantel tests方法一致，將經過篩選的土壤理化因子與細菌群落結構進行冗余分析RDA)，RDA二維排序圖可以直觀地給出研究對象與環境變量之間的關系，排序軸與箭頭連線夾角表示環境因子與排序軸的相關性，夾角越小表明關系越密切，而箭頭連線表示環境因子與研究對象相關程度的大小，連線越短，相關性越小，反之越大。所有樣品因環境因素的不同而聚類或分離的情況，蒙特卡羅檢驗(Monte Carlo test)發現，特征根的F=2.76，軸1，軸2，軸3和軸4的特征根的相關系數分別為0.953，0.967，0.853，0.981，到軸4的累計合理解釋變量為87.36%，故RDA分析排序結果可信。環境變量間夾角的余弦值表示二者的相關關系，ND和HD土壤細菌組成差異較大，MD和HD位于二、三象限，ND和LD位于一、四象限。SOC和pH值的射線較長，表明其對細菌群落組成影響較大，而AP值的射線較短，說明其對細菌群落組成影響較小；在土壤pH值，SOC，TN對土壤細菌群落結構具有較大影響，同時不同沙化草地土壤細菌群落發生明顯分異，ND土壤細菌群落主要處于土壤pH值較高區域，而HD土壤細菌群落主要聚類于土壤含水量較高的區域，不同沙化草地土壤細菌群落結構較為分散，其中Actinobacteria，Acidobacteria群落與pH值顯著負相關，Proteobacteria群落與SOC，TN呈顯著正相關。

圖2 基于門(A)和綱(B)水平下的土壤細菌分布與環境因子的關系

3 討論與結論

3.1 不同沙化草地土壤細菌多樣性及群落組成

川西北草地生態系統是全球變化的敏感區域，其微生物組成和功能影響生態系統轉化的方向和進程[8]。本研究中，未沙化草地土壤養分含量高于沙化草地，這可能與土壤含水量較高有關，而土壤水分是調節生態系統土壤微生物物質轉化的關鍵因子，沙化草地土壤含水量較低，破壞較為嚴重，受干擾程度較高，因此，其土壤養分含量較低，其中重度沙化草地土壤含水量最低。土壤細菌是土壤微生物的重要組成部分，絕大多數土壤優勢細菌種類基本相同，主要包括10個左右的細菌類群。Chu等[17]在青藏高原西北部研究表層土壤細菌群落結構發現放線菌門、α-變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門5大門類為研究區的優勢類群。厚壁菌門、γ-變形菌門、β-變形菌門、δ-變形菌門、擬桿菌門、浮霉菌門6大門類為平均相對豐度小于5%大于1%的細菌門類，與本研究基本一致。而Yuan等[18]在念青唐古拉南面沿海拔梯度取樣研究高山草原土壤細菌群落發現酸桿菌門、變形菌門、芽單胞菌門為研究范圍內最主要的3個細菌門類。Zhang等[19]在青藏高原北麓河流域分析草甸、草原和荒漠草原土壤細菌群落結構差異發現主要優勢菌群為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門4個門類，這可能與當地的氣候、水文、土壤、植被條件不同有關，似乎沒有兩種土壤包含完全一致的微生物群落結構。本研究中土壤細菌優勢菌群，與其他研究相比厚壁菌門相對豐度較高，這可能與厚壁菌門更能適應川西北沙化草地土壤環境和利用有限的土壤養分有關，草地沙化引起了放線菌門相對豐度的增加，放線菌最適生長環境土壤pH值偏堿性，因此重度沙化草地土壤環境更適宜放線菌的生長。

大量研究表明，草地沙化、破壞和干擾會改變土壤細菌的群落多樣性，通過植被恢復促進土壤形成團聚體，從而提高土壤的穩定性，在植被恢復的生態環境效應方面起著重要作用[20-21]。而土壤細菌的生長主要受土壤的理化性質與環境因子的影響。不同土地利用方式因其管理措施的不同，對土壤理化性質的影響存在很大差別，對土壤細菌群落結構的影響也不同。土壤微生物多樣性指數表示生物群落中的物種多寡，數值愈大表示物種越豐富；優勢度指數越大，生物群落內的優勢種越突出，生物種群豐富和多樣性指數高是生態環境健康穩定的重要表現[22-23]。根據表3可知，未沙化草地土壤細菌多樣性指數均高于沙化草地，與前人的研究結果一致，說明草地沙化降低了土壤微生物多樣性。草地沙化過程中，降低了植被凋落物，從而降低了細菌對養分的吸收、利用和轉化，進而影響了土壤細菌群落生長。

3.2 不同沙化草地土壤細菌群落組成與土壤養分的關系

研究區土壤細菌群落結構和α多樣性與土壤pH值、土壤有機碳和全氮顯著相關。土壤pH值是影響土壤細菌群落分布的最主要影響因子。Rousk等[24]對具有pH值梯度的農田土壤180 m距離(小尺度)內土壤微生物群落結構和多樣性采用高通量測序分析，結果表明土壤細菌群落結構組成和多樣性與土壤pH值密切相關。Fierer等[25]利用末端限制性片段長度多態性分析了美洲大陸從北到南土壤細菌群落多樣性和生物地理分布模式，發現土壤細菌群落豐富度和多樣性與土壤pH值相關。Shen等[26]在長白山研究6種典型植被類型，采用高通量技術研究土壤細菌群落組成和多樣性隨海拔的分布規律，發現土壤pH值是驅動土壤細菌分布的影響因子，與本研究結論一致。同時SOC和TN也是土壤細菌群落結構和多樣性的主要影響因子。而Chu等[17]在對青藏高原西北部大尺度研究表層和亞表層土壤細菌群落分布時發現總碳和碳氮比是青藏高原微生物生物地理分布的主要影響因子。植被類型可能通過凋落物和根際分泌物影響土壤微環境并間接地改變了土壤細菌的群落結構和多樣性。對于未沙化草地，具有密實的根系，土壤有機碳含量較高；而重度沙化草地草本覆蓋度低，土壤有機碳和總氮含量低，土壤微環境的營養差異可能改變土壤細菌群落結構和多樣性。當土壤微生物有適宜的營養物質、土壤pH值和良好的水熱條件，有利于土壤微生物的生長和繁殖[27-29]。總體來看，土壤細菌群落組成與土壤pH值和含水量密切相關，而當土壤pH值相似時，土壤養分可能是細菌結構的重要影響因子。

隨土壤肥力及環境狀況的不同，土壤微生物種群數量也會存在不同程度的差別。本研究中，不同沙化草地之間土壤養分含量不同，土壤優勢細菌門、綱的相對豐富度也不同，說明土壤營養元素含量的變化導致了土壤細菌的組成及群落結構的變化。細菌的優勢菌門有Proteobacteria，Actinobacteria，Acidobacteria，Chloroflexi，Gemmatimonadetes，Firmicutes，雖然不同沙化草地之間土壤細菌群落物種組成相似，但土壤細菌門、綱、種的相對豐度不同，可能是因為植物類型不同以及其向土壤提供的營養物質的形式與含量存在差異。Actinobacteria能夠降解復雜的木質素與纖維素，為土壤提供養分，圖1可知，Proteobacteria是最主要的優勢菌門，其結果表示Proteobacteria為堿性土壤中主要優勢菌群，在本研究優勢菌Proteobacteria門中，α-Proteobacteria是最主要的亞門，其次是β-Proteobacteria，然后是δ-Proteobacteria，與Zhang等[19]研究結果不一致，在其研究結果中，β-Proteobacteria是Proteobacteria門中豐富度最高的亞門，這可能是因為所選取的研究區域不一樣，其土壤結構、含水率等環境因素差異較大，土壤細菌的群落組成也就不一樣，優勢菌主要亞門也就不相同。RDA分析發現，α-Proteobacteria主要受pH值SOC的影響，Acidobacteria與SOC顯著相關，說明草地沙化明顯改善了土壤的理化性質，改變了土壤細菌的群落組成。本研究表明SOC和TN是該研究區域影響土壤細菌群落組成與多樣性特征的主要理化性質因素，草地沙化明顯改變了土壤細菌群落組成。