四氯化碳誘導(dǎo)ICR小鼠和C57小鼠的肝纖維化模型比較

鐘 霞，王 麗，王洪連，沈宏春，徐川嵐，劉育杭

(1.四川省瀘州市西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心,四川 瀘州 646000；2.四川省瀘州市西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000)

肝纖維化(Liver Fibrosis)的發(fā)生與慢性肝損傷的病因有關(guān)，包括乙型肝炎和丙型肝炎、飲酒、脂肪肝、膽汁淤積和自身免疫性肝炎，表現(xiàn)為肝臟細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的失衡，若纖維化持續(xù)進(jìn)展，會(huì)出現(xiàn)肝臟結(jié)構(gòu)紊亂和功能受損，誘發(fā)肝硬化、肝衰竭，甚至導(dǎo)致肝癌發(fā)生[1]。目前防治肝纖維化已成為研究熱點(diǎn)，而構(gòu)建一種有效的肝纖維化動(dòng)物模型是進(jìn)行肝纖維化研究的重要基礎(chǔ)。采用四氯化碳(CCl4)化學(xué)誘導(dǎo)方式建立肝纖維化模型，是常用的一種簡單、快速、高效的造模方式，而不同品系的小鼠對(duì)于該造模方法的敏感性不同，模型構(gòu)建的結(jié)果也會(huì)有所差別。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)兩種品系小鼠采用CCl4誘導(dǎo)肝纖維化造模方式進(jìn)行造模，對(duì)比觀察兩者肝臟結(jié)構(gòu)和功能等方面的差異，以探求一種高效、穩(wěn)定的肝纖維化疾病模型。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇30只ICR(Institute of Cancer Research)小鼠和30只C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，均為雄性，8周齡，體重20～25 g，購自西南醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證：SYXK(川)2013-065]。

1.2藥物與試劑：CCl4溶液購于成都金山化學(xué)試劑有限公司；橄欖油購于上海生工生物工程股份有限公司(批號(hào)：C316BA0013)；正置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司；苦味酸-天狼星紅染色試劑盒購于上海博谷生物科技有限公司(批號(hào)：PT036)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購于碧云天試劑有限公司(批號(hào)：C0105)；Fibronectin抗鼠單克隆抗體購自abcam公司(貨號(hào)：ab11575)；collgen-I、collgen-III抗體購自Cell Signaling Technology 公司；ɑ- SMA抗兔單克隆抗體購自abcam公司。

1.3方法

1.3.1模型建立及標(biāo)本采集：ICR小鼠和C57小鼠各30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將ICR小鼠隨機(jī)分為ICR正常組、ICR陰性對(duì)照組(橄欖油)、ICR模型組；將C57小鼠分為C57正常組、C57陰性對(duì)照組和C57模型組，每組各10只，自由飲水和進(jìn)食。用橄欖油將四氯化碳分析純配制成20% 的CCl4混懸液。兩模型組予以腹腔注射2 ml/100 g 20% CCl4混懸液，1次/d，每注射5 d，間隔2 d，連續(xù)8周；兩組對(duì)照組予以注射相同劑量橄欖油，正常組不做任何處理。觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)、飲水量、精神狀況及體重變化等一般情況。8周后，戊巴比妥鈉麻醉，收集全血分離血清；收集肝臟組織，部分暫時(shí)凍存于-80℃，部分予以4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋。

1.3.2檢測(cè)肝臟功能：各組小鼠連續(xù)給藥8周后，腹腔注射麻醉，收集全血分離血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清AST、ALT水平，評(píng)估肝臟功能損害。

1.3.3觀察肝臟組織病理形態(tài)：采集肝臟組織，用10%中性甲醛固定，脫水包埋后石蠟切片。對(duì)肝組織切片進(jìn)行HE和苦味酸-天狼星紅染色，光鏡觀察病理形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。

1.3.4Western blot檢測(cè)肝纖維化相關(guān)指標(biāo)蛋白水平：稱取小鼠肝組織 0.05 g，提取肝組織蛋白。取50 μg蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)移后，用5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入Fibronectin、α-SMA、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ一抗(稀釋比例 1∶1 000)4 ℃ 孵育過夜，TBST洗滌3×5 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)二抗(稀釋比例1∶3 000)常溫孵育1 h，TBST 洗滌3×5 min后，采用凝膠成像儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以目標(biāo)蛋白和內(nèi)參的相對(duì)灰度值表示。

1.3.5Real time PCR檢測(cè)肝纖維化相關(guān)指標(biāo)mRNA水平：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)法測(cè)定組織α-SMA mRNA水平的表達(dá)。用trizol法提取組織總 RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所得總RNA的純度和濃度，再用cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95 ℃ 15 s，55℃ 15 s，72 ℃ 30 s)。Real-time PCR反應(yīng)體系如下：SYBR green PCR mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，稀釋cDNA 9 μl，共計(jì)20 μl。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量3次，用2-△△Ct法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠血清AST、ALT含量測(cè)定結(jié)果：與對(duì)照組比較，2個(gè)模型組的小鼠血清ALT、AST水平均明顯升高(P<0.05)，而ICR小鼠模型組和C57小鼠模型組相比，ICR小鼠的AST、ALT含量明顯增高(P<0.05)。見表2。

2.2病理組織學(xué)結(jié)果

2.2.1肝臟HE染色結(jié)果：兩正常組及兩對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，小葉間和匯管區(qū)基本無膠原纖維分布。C57小鼠模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞顆粒變性明顯，可見肝細(xì)胞脂肪變性。ICR小鼠模型組可見肝細(xì)胞內(nèi)大量脂肪空泡堆積，脂肪變性較C57模型組更為明顯，另外可見中央靜脈周圍纖維增多并向外延伸，形成纖維間隔。見圖1。

表1引物基因序列

組別AST ICR小鼠 C57小鼠 ALT ICR小鼠 C57小鼠 正常組125.800 0±8.786130.800±12.91139.000±7.51658.000±9.848對(duì)照組145.200 0±18.660166.600±33.21549.000±17.02991.600±30.753模型組4 222.800±1 034.243①3 052.200±585.951①3 473.400±1 669.293①2 376.600±500.397①

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

圖1 兩種品系小鼠蘇木精伊紅(HE)染色比較(200×)：A：ICR小鼠正常組；B：ICR小鼠對(duì)照組；C：ICR小鼠模型組；D：C57小鼠正常組；E：C57小鼠對(duì)照組；F：C57小鼠模型組

2.2.2肝臟苦味酸-天狼星紅染色結(jié)果：兩正常組及兩對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，僅有少量血管壁著紅色。C57小鼠模型組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，匯管區(qū)及中央靜脈周圍大量著紅色的纖維組織增生，形成纖維間隔及假小葉，肝細(xì)胞排列緊密性下降，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性。與C57小鼠模型組相比，ICR小鼠模型組可見大量粗大的膠原纖維沉積，纖維間隔更多更寬，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞更加嚴(yán)重，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，另外可見部分肝細(xì)胞壞死。

2.3Western bolt檢測(cè)纖維化通路相關(guān)蛋白 ：蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組小鼠肝組織中Fibronectin、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的蛋白含量，與對(duì)照組比較，兩組CCl4模型組均明顯增高(P<0.001)；而兩組小鼠模型組相比較，ICR模型組的Fibronectin、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量上升更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 各組小鼠肝組織Western blot結(jié)果：A：ICR小鼠正常組；B：ICR小鼠對(duì)照組；C：ICR小鼠模型組；D：C57小鼠正常組；E：C57小鼠對(duì)照組；F：C57小鼠模型組

圖4 各組小鼠肝組織纖維化相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果：A：兩種小鼠的模型組與對(duì)照組比較，④P<0.001；B：ICR小鼠模型組與C57小鼠模型組比較，①P<0.05，②P<0.01，③P<0.01

2.4Real-time PCR檢測(cè)肝纖維化相關(guān)基因：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩種品系小鼠肝組織中α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組比較，兩組CCl4模型組中α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA的表達(dá)均明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；而兩組小鼠模型組相比較，ICR小鼠模型組的Fibronectin、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量上升更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組小鼠肝組織Real-time PCR結(jié)果：A：兩種小鼠的模型組與對(duì)照組比較，③P<0.001。 B：ICR小鼠模型組與C57小鼠模型組比較，①P<0.05，②P<0.01

3 討論

肝纖維化的產(chǎn)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，發(fā)病機(jī)制主要是多種因素通過不同方式和途徑作用于肝臟中的肝星狀細(xì)胞(HSC)以及纖維形成細(xì)胞，導(dǎo)致其生物學(xué)及功能變化，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[2-3]。經(jīng)多種臨床研究發(fā)現(xiàn)，在纖維化發(fā)展的早期階段，去除原發(fā)病因可有效減緩纖維化甚至使其逆轉(zhuǎn)并恢復(fù)至正常結(jié)構(gòu)，因此，在肝纖維化治療過程中，及時(shí)阻斷或延緩纖維化的發(fā)生是肝臟疾病預(yù)后的關(guān)鍵。中醫(yī)藥通過降低肝纖維化大鼠TGF-β/Smads通路和及P-STAT3、P38MAPK、a-SMA的表達(dá)從達(dá)到改善肝功能，減輕肝損害，抑制肝纖維細(xì)胞個(gè)膠原纖維的增生，進(jìn)而發(fā)揮抗纖維化的作用[4-5]。目前，建立肝纖維化模型的方法大致有腹腔注射CCl4、膽總管結(jié)扎、復(fù)合多因素法和二乙基亞硝胺誘導(dǎo)等，不同的方法其誘導(dǎo)肝纖維化產(chǎn)生的機(jī)制也不同[6-8]。CCl4作為應(yīng)用最廣泛的化學(xué)性肝毒性物質(zhì)，其簡便、快捷、成功率高的優(yōu)點(diǎn)是建立肝纖維化動(dòng)物模型是使用最多的方法[9-11]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)肝纖維化模型小鼠肝功能指標(biāo)檢測(cè)及肝組織病理學(xué)觀察，對(duì)比分析不同種屬之間肝纖維化造模程度的差異，證實(shí)在相同的實(shí)驗(yàn)條件下腹腔注射CCl4致小鼠肝纖維化，ICR小鼠對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的造模方式更為敏感，肝纖維化程度明顯高于C57小鼠。