CXCR4抑制劑AMD3100對人卵巢癌OVCAR3細胞凋亡的影響

龍 芳，文 芳，聶 蕾，張其柱，吳章穎，訾 聃△，張家龍，李 誼

(1.貴州醫科大學附屬醫院婦產科，貴陽 550004； 2．貴州省六盤水市婦幼保健院婦產科 553000；3.貴州省六盤水市人民醫院病理科 553000；4.貴州省六盤水市婦幼保健院病理科 553000)

卵巢惡性腫瘤是我國女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，資料顯示，卵巢腫瘤發病率越來越高，對婦女生命造成嚴重威脅。在全球范圍內，每年有12.5萬人死于卵巢腫瘤[1]，2010年我國因卵巢癌死亡的病例約1.76萬例[2]。卵巢腫瘤形成過程中存在著包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡調控基因的失調等各類基因表達的異常情況發生，同時研究發現腫瘤易發生細胞侵襲轉移的特性與趨化因子受體可促進腫瘤的生長、血管的生成及腫瘤的遠處轉移密切相關[3]。有足夠的原始研究性文章可以證實趨化因子12(CXCL12)/CXCR4 在腫瘤細胞的凋亡過程中起到非常關鍵的作用。在眾多凋亡控制基因中，B淋巴細胞瘤/白血病-2基因(Bcl-2)蛋白家族和半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)家族最受關注，目前國內外對于CXCR4與細胞凋亡相關因子(Bcl-2、Bax、caspase-3)聯合研究較少，故本研究希望為卵巢癌的靶向治療提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1組織及細胞來源 選擇貴州醫科大學附屬醫院、貴州省六盤水市婦幼保健院病理科及貴州省六盤水市人民醫院病理科存檔石蠟標本上皮性卵巢癌患者39例為惡性組，其中早期(FIGO Ⅰ、Ⅱ)卵巢癌26例，晚期(FIGO Ⅲ、Ⅳ)卵巢癌13例，漿液性癌35例，黏液性癌4例，年齡29～72歲，中位年齡49歲。選擇同一時期40例卵巢良性上皮腫瘤患者手術切除標本作為良性對照組。卵巢癌細胞株OVCAR3購自昆明醫科大學細胞庫中心。

1.2主要試劑 DMEM高糖、胰酶消化液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、雙抗(美國Hyclone)，胎牛血清(德國PAN Bitech公司)，CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3多克隆抗體(英國Abcam公司)，AMD3100(美國Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 卵巢癌細胞株OVCAR3常規培養于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中進行培養，PBS沖洗2～3次，0.25%的胰酶常規消化傳代。細胞分為3組：陰性對照組(PBS)、AMD3100 10 μg/mL組及AMD3100 100 μg/mL組。

1.3.2免疫組織化學法 收集的標本均經10%中性甲醛固定，常規切片行蘇木素-伊紅(HE)染色。免疫組織化學染色方法按試劑盒說明書進行，每批染色均用PBS代替一抗作陰性對照，陽性對照片由武漢博士德生物工程有限公司提供。采用雙盲閱片，半定量積分法判定結果。以細胞核、細胞膜或細胞質呈黃色顆粒為陽性，每張切片于高倍鏡下選10個視野，每個視野計數100個細胞，陽性細胞百分比小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。染色呈淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分。以上兩項評分的乘積小于3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)。

1.3.3Western blot檢測CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達水平 取對數生長期細胞，置于無血清培養液中培養過夜，提取OVCAR3細胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后脫脂，室溫封閉2 h后加入一抗抗體，4 ℃過夜，TBST漂洗后，分別加二抗孵育，后用TBST漂洗，加入DAB顯色液，待陽性區帶顯色清晰后拍照記錄。

1.3.4細胞凋亡實驗 選擇對數生長期細胞，胰酶消化,制備成細胞懸液，計數板計數，取含10萬個細胞以上的細胞懸液，PBS溶液重懸加入Annexin溶液混勻，室溫避光孵育10～15 min，離心，PBS 洗滌細胞，重懸細胞，加入碘化丙啶(PI)染色細胞，4 ℃下避光孵育20 min，流式細胞儀分析凋亡率。

2 結 果

2.1CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3在惡性組及良性對照組中的表達 免疫組織化學染色顯示惡性組CXCR4、Bcl-2的表達高于良性對照組，Bax表達低于良性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；caspase-3在惡性組和良性對照組中的表達差異無統計學意義(P>0.05)；惡性組CXCR4蛋白的表達與Bcl-2呈正相關(r=0.480,P<0.05)，與caspase-3蛋白表達呈負相關(r=-0.475，P<0.05)。Bax、Bcl-2之間無相關性(P>0.05)，見表1，圖1。

表1 CXCR4、Bcl-2、Bax 及caspase-3在兩組腫瘤中的表達(n)

圖1 EXCR4、Bax、Bcl-2、caspase-3在上皮性卵巢癌中的表達(免疫組織化學×200)

項目nCXCR4-+χ2PBcl-2-+χ2P年齡(歲)0.4420.6471.0910.296 ≤603415191222 >6053232病理分級(期)9.6120.00212.4420.000 G1～G21111092 G3281711622病理類型1.5320.3180.3600.548 漿液性3515201421 黏液性43113淋巴結轉移14.3150.00011.8300.001 陰性18144126 陽性21417318大網膜轉移7.6390.0067.8310.005 陰性13103 94 陽性26818620腹水癌細胞0.1990.7527.4620.006 陰性1899117 陽性21912417臨床分級(級)7.6390.0060.0110.918 Ⅰ+Ⅱ13103914 Ⅲ+Ⅳ26818610CA125(IU/L)5.3720.0352.368 0.124 ≥353212201418 <3576116

續表2 上皮性卵巢癌組織中CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3的表達與臨床病理特征的關系

續表2 上皮性卵巢癌患者中CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3的表達與臨床病理特征的關系

2.2CXCR4、Bcl-2、Bax和caspase-3在上皮性卵巢癌中的表達與臨床病理特征的關系 CXCR4在上皮性卵巢癌組織中的表達與病理分級、淋巴結轉移、大網膜轉移、臨床分期、CA125水平有關(P<0.05)；與年齡、病理類型、腹水中是否找到癌細胞無關(P>0.05)；Bcl-2在上皮性卵巢癌組織中的表達與病理分級、淋巴結轉移、大網膜轉移、腹水中是否找到癌細胞有關(P<0.05)；與年齡、病理類型、臨床分期、CA125水平無關(P>0.05)。Bax 在上皮性卵巢癌組織中的表達與淋巴結轉移、CA125水平有關(P<0.05)；與年齡、病理類型、臨床分期、腹水中是否找到癌細胞、大網膜轉移、病理分級無關(P>0.05)；caspase-3在上皮性卵巢癌組織中的表達與病理分級、淋巴結轉移、臨床分期有關(P<0.05)；與年齡、病理類型、大網膜轉移、腹水中是否找到癌細胞、CA125水平無關(P>0.05)，見表2。

A:Western blot圖；B：定量分析圖；a:P<0.05;b:P<0.01

圖2不同濃度AMD3100對卵巢癌細胞CXCR4的

蛋白表達水平的影響

A：Western blot圖；B～D：Bax、Bcl-2、caspase-3定量分析圖；a:P<0.05;b:P<0.01

圖3不同濃度AMD3100對卵巢瘤細胞Bax、Bcl-2及caspase-3的蛋白表達情況

2.3不同濃度AMD3100對卵巢癌細胞CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達的影響 與陰性對照組比較，AMD3100 10 μg/mL組、AMD3100 100 μg/mL組CXCR4蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與陰性對照組比較，Bax、caspase-3蛋白表達升高，而Bcl-2蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05),見圖2、3。隨著AMD3100濃度增大，Bcl-2/Bax值變小，見圖4。

2.4不同濃度AMD3100對卵巢癌細胞凋亡的影響 與陰性對照組比較，AMD3100 10 μg/mL組、AMD3100 100 μg/mL組細胞凋亡率增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖4 不同濃度AMD3100對卵巢癌細胞Bax/Bcl-2的影響

A：陰性對照組；B:AMD3100 10 μg/mL組;C:AMD3100 100 μg/mL組;D:凋亡分析圖；a:P<0.05;b:P<0.01

圖5流式細胞術檢測OVCAR3細胞凋亡

4 討 論

卵巢癌是女性患者中常見的癌癥，超過半數以上的卵巢癌病理類型為上皮性卵巢癌。該病起病隱匿，大多數患者初次就診時即為晚期，且十分容易轉移[4]，其病死率占婦科惡性腫瘤的第1位。可見，了解相關的分子調控機制在卵巢癌的發生發展過程中有積極意義。研究發現卵巢癌細胞會高表達趨化因子受體CXCR4，其與配體趨化因子CXCL12構成的 CXCL12-CXCR4 生物學軸，與腫瘤細胞的增殖、散播、免疫排斥反應及腫瘤的新生血管形成有關[5-7]，因此，本研究檢測在人體上皮性卵巢癌組織中CXCR4及相關凋亡因子的表達，同時利用CXCR4的抑制劑AMD3100，在細胞實驗中靶向阻斷CXCR4后觀察其對卵巢癌細胞凋亡的影響。

細胞凋亡是一種細胞主動性死亡方式?，F在認為腫瘤可能是細胞凋亡通路受阻，使本該死亡的細胞繼續存在產生的。常見的凋亡基因有Bcl-2家族、p53家族和caspase家族等。目前已經發現的Bcl-2家族按功能可分為兩類，一類具有抑制凋亡作用，如Bcl-2；而另一類具有促進凋亡作用，如Bax。研究表明激活Bax基因能促進SKOV3細胞凋亡[8]，Bcl-2對大鼠海馬神經元凋亡有抑制作用[9]。caspase-3作為凋亡caspase依賴途徑中的中心分子，對調亡過程起著級聯放大作用，是大家公認的細胞凋亡下游關鍵執行者，有研究發現它能有效地阻止血管新生，從而阻止腫瘤的發展。本研究發現上皮性卵巢癌組織CXCR4、Bcl-2的表達高于良性腫瘤組織，Bax表達低于良性腫瘤組織，差異有統計學意義(P>0.05)；說明CXCR4、Bcl-2、Bax的表達與腫瘤的發生有密切關系。研究表明表達CXCR4的SGC7901胃癌細胞在 CXCL12 的作用下可能激活 PI3K/Akt 信號途徑，增強胃癌細胞的抗凋亡作用[10]。通過下調卵巢癌細胞株中CXCR4 的表達，能促進卵巢癌細胞的凋亡，并能有效地降低卵巢癌細胞的侵襲能力[11]。筆者推測CXCR4的高表達可以降低細胞的凋亡能力，從而參與了腫瘤的發生發展及侵襲轉移。本研究在進一步研究CXCR4及凋亡相關因子的表達水平與患者臨床病理特征的關系時發現CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3在上皮性卵巢癌組織中的表達均與淋巴結轉移有關，而淋巴結轉移是評定卵巢癌預后的重要指標之一，說明4者均參與了上皮性卵巢癌的侵襲與轉移。相關性分析發現CXCR4蛋白的表達與Bcl-2呈正相關，而與caspase-3蛋白表達呈負相關，說明CXCR4可能通過某種途徑來調控Bcl-2與caspase-3，此結果與有關報道相一致[12-13]。

AMD3100是一個高度特異性的細胞因子受體拮抗劑，選擇性抑制CXCL12與CXCR4結合，阻斷CXCL12、CXCR4生物軸的生理功能，從而抑制腫瘤的發生發展[14]。在本研究中，采用Western blot檢測CXCR4的表達，發現隨著AMD3100濃度的增大，CXCR4的表達明顯受到抑制，再次證實了AMD3100可以靶向阻斷CXCR4的表達。同樣有研究發現AMD3100作用人淋巴瘤細胞株Ramos細胞后，隨著藥物濃度的增加，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，凋亡增加[15]。AMD3100能夠誘導乳腺癌細胞及直腸癌細胞的凋亡，并能有效地降低其增殖與遷移能力[16]。也能夠引起骨髓細胞的凋亡的同時減少腫瘤血管的灌注[17]。說明CXCR4可能通過某種路徑對凋亡基因進行調控，從而參與腫瘤細胞凋亡過程。張丹等[18]研究發現降低Bcl-2/Bax比值可誘導SMMC-7721細胞凋亡，抑制細胞增殖可能的機制為Bcl-2/Bax值相當于啟動細胞凋亡的“分子開關”，Bax增高可促進細胞凋亡；Bcl-2升高可抑制細胞凋亡。因此，有研究推斷，Bcl-2與Bax的比值決定著細胞受凋亡刺激后的生存能力。在本研究中，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示：隨著AMD3100濃度的增大，Bcl-2/Bax值變小，細胞凋亡率增加。caspase-3在機體中與別的凋亡蛋白家族成員發揮相互作用，通過降解凋亡抑制蛋白Bcl-2，激活caspase家族成員發生水解，產生級聯反應，最終導致DNA在核小體連接處被分割成DNA鏈接片段，細胞凋亡由此發生。在本研究中，隨著AMD3100濃度的增加，caspase-3的表達增加，細胞凋亡明顯增加，此結果與龐雪利等[19]研究結果相一致。故可推測，CXCR4可能通過某種途徑調控Bax/Bcl-2值的變化，同時上調caspase-3的表達，因此筆者推測阻斷CXCR4的表達，可以誘導細胞的凋亡。

卵巢癌是婦科高發的惡性腫瘤之一，治療后易復發的特點是臨床治療的一個難點。本研究表明，利用特異性抑制劑AMD3100對CXCR4進行靶向阻斷，增加了細胞凋亡，其機制可能是通過阻斷CXCR4后抑制凋亡相關蛋白Bcl-2的表達，同時促進Bax、caspase-3表達實現的。這或許能成為卵巢癌治療的一個新的理論依據，但其確切的作用機制有待進一步深入研究。