黏膜相關淋巴組織淋巴瘤中Ig蛋白重鏈表達與IgH基因重排的研究

林海月，王紅霞，胡東東，陳 昊△

(江蘇省連云港市第一人民醫院/徐州醫科大學附屬連云港醫院:1.病理科；2.婦產科，江蘇連云港 222002)

近年來黏膜相關淋巴組織淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma，MALToma)發病率有所提高，居非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin′s lymphoma,NHL)的第二位[1-2]，因缺乏特征性的免疫標記，仍屬于排他性診斷。MALToma與反應性淋巴組織增生(reactive lymphoid hyperplasia，RLH)的鑒別尤其困難，而兩者的鑒別直接影響患者的治療及預后，意義重大。本研究以MALToma與MALToma細胞起源接近的濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)、同為生發中心后B2譜系的漿細胞淋巴瘤(plasmacytoma，PC)為研究對象，立足于Ig蛋白重鏈可變區的IgH基因重排與重鏈恒定區的抗體類別轉換，分

表1 試驗組及對照組中各種Ig蛋白重鏈表達情況及表達模式[n(%)]

a:試驗組間比較；b：試驗組各腫瘤分別與對照組比較;c:Fisher檢驗；d:試驗組與對照組比較；▲:IgE在各組中均為陰性表達，因而不列入表中;-:此項無數據

析IgH基因重排與Ig重鏈表達的情況，以期找到有利于MALToma診斷和鑒別診斷的新方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集江蘇省連云港市第一人民醫院病理科2009年6月至2016年11月存檔蠟塊B細胞NHL(B-NHL)50例(包括MALToma 30例、FL 10例、PC 10例)作為試驗組，另選取RLH 10例作為對照組。參照第四版造血與淋巴組織腫瘤WHO分類診斷標準，所有病例經兩位高年資病理醫師復核診斷，將MALToma、FL、PC和RLH依病理號從MI、FI、PI、RI開始依次編號。30例MALToma中，男14例，女16例，年齡28～77歲，中位年齡60.5歲，參照 Ann Arbor臨床分期，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為16、11、1、2例；依據國際預后指數(IPI)危險度分級分為低危組20例、中危組9例、高危組1例。FL中男3例，女7例，年齡46～80歲，中位年齡61.5歲；PC中男3例，女7例，年齡45～72歲，中位年齡63.5歲；RLH中男6例，女4例，年齡39～76歲，中位年齡59歲。對30例MALToma患者進行電話隨訪，隨訪時間截止于2017年6月19日，21例獲得隨訪資料，隨訪33～418周，疾病進展6例，死亡1例，無進展生存期(progression free survival,PFS)為33～143周。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學 全部標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。采用EnVision兩步法檢測兩組中Ig蛋白重鏈表達，操作流程嚴格參照試劑說明書要求。IgM、IgA、IgD、IgG為即用型工作液(購自廣州安必平醫藥科技股份有限公司)，IgE為濃縮液(購自Abcam公司)，以1∶500倍稀釋，均為兔抗人抗體。

1.2.2PCR QIAamp DNA FFPE Tissue Kit購于Qiagen公司，IgH基因重排試劑盒(包括IgHA、IgHB、IgHC、IgHD、IgHE占管引物)購于InvivoScribe公司，Taq酶購于ABI公司，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)及GelRed等試劑均購于北京思爾成生物技術有限公司，操作流程嚴格參照說明書要求。

1.3結果判定 免疫組織化學判讀標準：5種Ig蛋白陽性染色均為細胞質出現棕黃色顆粒，每張切片選取5個具有典型病變的視野(×100)，各視野計數200個細胞，按照半定量積分法分為陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)、強陽性(+++)。IgH基因重排判讀標準：(1)電泳條帶邊緣整齊，寬度不超過1 mm；(2)產物在期望范圍內；(3)如若背景上無涂抹帶，同時也無引物二聚體即是擴增失敗，而不是出現陰性結果；(4)期望范圍以外的其余條帶，則為人工假象。

1.4統計學處理 采用SPSS16.0軟件對結果進行統計學分析，采用χ2檢驗進行組間陽性率的比較，采用Spearman進行相關性分析，生存分析采用Kaplan-Meier法。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1試驗組與對照組中Ig蛋白重鏈表達及IgH基因重排情況 研究中將Ig重鏈表達分為3種模式，模式1：單種Ig重鏈表達；模式2：全陰性Ig重鏈缺失表達；模式3：多種Ig重鏈表達。試驗組及試驗組3種腫瘤模式1/2檢出率與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05),見表1。3種腫瘤、試驗組及對照組中5管引物檢出率及組合檢出率見表2。試驗組(74.0%)及對照組(0)中IgH基因單克隆重排檢出率差異有統計學意義(χ2=16.301，P<0.05)；生發中心來源的MALToma(73.3%)和PC(70.0%)略低于生發中心來源的FL(80.0%)，但試驗組3種腫瘤間比較差異無統計學意義(χ2=0.285，P>0.05)。IgH基因重排電泳圖見圖1。

2.2試驗組中IgH基因重排與Ig蛋白重鏈表達模式的關系 試驗組及試驗組3種腫瘤中IgH基因重排陽性組、陰性組中Ig重鏈模式1/2與模式3的檢出率間比較差異均無統計學意義(P>0.05)；IgH基因單克隆重排檢出率和Ig重鏈模式1/2檢出率亦無相關性(P>0.05)，見表3。將IgH基因檢測陽性或Ig重鏈表達呈模式1/2的病例均計為陽性，兩者聯合檢測在試驗組及MALToma、FL、PC中的陽性率顯著升高，分別為94.0%(47/50)、96.7%(29/30)、90.0%(9/10)、90.0%(9/10)。

2.3MALToma中Ig蛋白重鏈表達模式及IgH基因重排與預后相關參數(臨床分期、危險度分型、無疾病進展期)的關系 本研究將Ig蛋白重鏈表達呈模式1/2計為方法一陽性，IgH基因呈單克隆重排計為方法二陽性，兩者聯合檢測任何一種出現陽性均計為方法三陽性，3種方法在不同臨床分期和危險度分型中差異均無統計學意義(P>0.05),見表4。Ig蛋白重鏈不同表達模式及IgH基因檢測陽性與陰性組中PFS的差異無統計學意義(P>0.05)。生存曲線見圖2。

表2 各組IgH基因重排結果[n(%)]

E管在209 bp處出現非特異性單克隆條帶

表3 試驗組中IgH基因重排與Ig蛋白重鏈表達模式的關系[n(%)]

a:IgH基因重排陽、陰性組間模式1/2檢出率的比較；b:IgH基因重排與Ig蛋白重鏈表達模式1/2、模式3的相關性分析；c：Fisher檢驗

圖A、B、C為M1、M2基因重排電泳圖;A-、A+、B-、B+、C-、C+、D-、D+、E-、E+分別為IgHA、IgHB、IgHC、IgHD、IgHE的陰性和陽性對照，M1為A、B、D管陽性，M2為B、C管陽性。陽性條帶范圍：IgHA為310～360 bp，IgHB為250～295 bp，IgHC為100～170 bp，IgHD為110～290 bp，390～420 bp，IgHE為100～130 bp。圖C：IgHE在209 bp處出現非特異性條帶

圖1 MALToma基因重排電泳圖

續表4 MALToma中Ig蛋白重鏈表達模式及IgH基因重排與預后相關參數的關系[n(%)]

a：Ⅰ期+Ⅱ期與Ⅲ期+Ⅳ期間陽性率比較；b：Fisher檢驗

A:IgH基因；B：Ig蛋白重鏈

圖2 IgH基因檢測陽性與陰性組及Ig蛋白重鏈模式1/2與模式3間PFS的比較(P=0.681、0.183)

3 討 論

B細胞在發育過程中在骨髓中首先發生Ig重鏈可變區VDJ基因重排，然后發生Ig輕鏈VJ基因重排，轉錄成RNA后再與重鏈恒定區轉錄的RNA并接成Ig分子，形成表達mIgM和mIgD的成熟B細胞后即進入外周免疫器官，經抗原刺激后于生發中心發生體細胞超突變和抗體類別轉換[3]。所謂抗體類別轉換即B細胞發生Ig重鏈恒定區的二次基因重排，由原先合成IgM和IgD的B細胞轉變為合成IgG、IgA或IgE的B細胞。根據腫瘤的單克隆學說，B細胞淋巴瘤應發生重鏈可變區IgH基因的單克隆重排，重鏈恒定區Ig蛋白編碼基因的單克隆重排并表達單種Ig蛋白重鏈。理論上，Ig重鏈可變區和恒定區均可作為檢測B細胞淋巴瘤單克隆性的兩個靶點，對于兩者關系的研究甚少。

一直以來國內外對于MALToma中Ig蛋白重鏈表達特點的研究較少，理論上腫瘤為單克隆增生，應為表達模式1。BENDE等[4]關于MALToma的研究中模式1陽性率達80%(16/20)，而有學者對彌漫性大B細胞淋巴瘤Ig蛋白表達的研究得出模式2(15/30)及模式3的表達(4/30)[5]，模式2/3的表達可能是由于腫瘤細胞Ig蛋白表達失調所致。本研究中MALToma、PC、FL及試驗組模式1/2陽性檢出率分別為86.7%、80.0%、60.0%、80.0%，RLH均表達模式3(P<0.05)，模式1/2的表達有助于試驗組3種腫瘤(尤其是MALToma)與RLH的鑒別診斷，因而筆者推測其為腫瘤特有，將其作為腫瘤的提示標記。IgH基因重排是B細胞分化過程中首先發生的事件，人們較常運用Biomed-2引物系統中針對IgH的5管引物檢測腫瘤的單克隆性[6]。受體細胞超突變的影響，生發中心前細胞來源的腫瘤單克隆重排檢出率高于生發中心及生發中心后來源的腫瘤[7]。本研究中3種腫瘤及試驗組IgH基因重排陽性率均達70%以上，與KOKOVIC等[8]、張婧等[9]的研究相符，因而Biomed-2引物系統對于B-NHL單克隆性的檢測具有重要的臨床病理應用價值。多數研究中IgH E管陽性率較低甚至為0[10-12]，本研究試驗組及對照組IgH E管均未檢出單克隆重排，因而筆者不推薦使用。關于IgH基因重排檢測與Ig蛋白重鏈表達的研究少見相關報道，本研究中IgH基因重排與Ig蛋白重鏈表達模式未見統計學關聯，說明二者作為檢測腫瘤單克隆性的兩個位點，相互獨立。MALToma、FL、PC及試驗組中兩者聯合檢測腫瘤單克隆檢出率分別升至96.7%(29/30)、90.0%(9/10)、90.0%(9/10)、94.0%(47/50)。3種腫瘤及試驗組中聯合檢測陽性率均提高到90%及以上，MALToma陽性率達96.7%，因而Ig蛋白重鏈檢測聯合IgH基因重排檢測可以提高腫瘤單克隆性的檢出率。

Ig蛋白重鏈表達模式與預后相關參數的分析少見相關報道，而一些學者對于IgH基因重排與預后相關參數的關系做過一些分析。SHAN等[13]對21例原發性胃淋巴瘤的研究中，IE期IgH單克隆重排檢出率為46.1%(6/13)，ⅡE期為100%(8/8)，其推測IgH單克隆重排檢出率隨臨床分期的升高而升高。有學者對彌漫性大B細胞淋巴瘤骨髓及外周血的研究顯示，IgH基因單克隆重排的陽性率隨著臨床分期及IPI的升高而升高，并與治療后完全緩解率相關[14]。上述國外研究提示IgH基因單克隆重排與高級別臨床分期、高的IPI及低治療緩解率等預后不良因素相關。已知MALToma常見染色體易位包括t(11;18)(q21;q21)、t(1;14)(p22;q32)、t(14;18)(q32;q21)、t(3;14)(p14;q32)[15]，其中有3種涉及14號染色體的IgH基因，筆者推測IgH基因單克隆重排的病例可能同時伴隨IgH基因的斷裂、染色體異位，繼而引起MALT1、Bcl-10、FOXP1等伴侶基因的激活，而引發腫瘤的預后不良。本研究發現MALToma中Ig蛋白重鏈表達模式、IgH基因單克隆重排與臨床分期、危險度分型及PFS等預后因素均無關，兩者聯合檢測與臨床分期、危險度分型亦無關，與上述研究的差異可能與腫瘤類型不同、標本例數少及隨訪時間短等相關。

綜上所述，單種Ig重鏈/全陰性Ig重鏈缺失表達的檢出對上述3種腫瘤的診斷具有提示意義。Biomed-2引物系統在MALToma、FL、PC中IgH基因單克隆重排具有較高的檢出率。兩者聯合檢測可以提高腫瘤陽性檢出率，對于以上3種腫瘤尤其是MALToma與RLH的鑒別診斷具有較高的臨床病理應用價值。