黔南州茶園土壤中優(yōu)勢菌株變幻青霉分離及鑒定

周小露 ，周才富 ，劉麗明，羅學尹，李興春，周才碧*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南長沙 410000；2.中共安龍縣委機要局，貴州安龍 552400；3.黔南民族師范學院生物科學與農(nóng)學院，貴州都勻 558000）

1 前言

貴州是種茶大省，其茶葉種植面積已高達700萬畝；其中黔南州的種植面積為150萬畝，占貴州省茶園總面積的21%，是重要茶區(qū)之一。黔南州明確提出有機茶的發(fā)展目標，在有機茶園的建設過程中，必須提高無害化有機肥的投入，構(gòu)建茶園動態(tài)植保體系。然而大量使用化學肥料會帶來土壤酸化、重金屬超標、農(nóng)藥殘留等問題。相關研究表明，貴州茶區(qū)如：都勻茶區(qū)[1，2]pH 值 3.00~4.00；湄潭和鳳岡在 4.00~4.50；正安在 4.00~5.00，土壤大面積有酸化情況。不僅如此，茶樹缺少大量元素，植株矮小，產(chǎn)量降低等問題也困擾著茶農(nóng)。生物有機肥制作使用的是天然原料，比如秸稈、微生物、腐殖質(zhì)等，在有效菌種發(fā)酵過程中產(chǎn)生的多種可溶性生理活性物質(zhì)，如有機酸、維生素等能被植物迅速吸收，既達到改善土壤結(jié)構(gòu)的目標，又可降低土壤的酸化程度[3-7]，加快土壤中氮、磷等元素循環(huán)[8-11]，減少Cd等[12]重金屬的累積，有助于緩解土壤酸化趨勢[13-14]，促進茶樹提早萌發(fā)[16]。

目前，可用于茶樹的生物有機肥較少，但使用化肥已經(jīng)對茶園造成嚴重危害，研制出可供茶樹使用的生物有機肥迫在眉睫，這就對生物技術(shù)專業(yè)的人員提出了新的市場研究方向。本實驗以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，分離、純化得到優(yōu)勢菌株，并通過形態(tài)鑒定和分子鑒定，旨在于明確優(yōu)勢菌株的背景，為其在茶園專用有機肥的開發(fā)提供參考。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

（1）土樣：采集于省黔南州都勻市三江堰茶園。

（2）蔗糖：化學純，天津市密歐化學試劑有限公司。

（3）瓊脂粉：北京鼎國昌盛生物技術(shù)責任有限公司。

（4）硝酸鈉：分析純，北京化工廠。

（5）七水合硫酸鎂：分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

（6）氯化鉀：分析純，天津市福晨化學試劑廠。

（7）七水合硫酸亞鐵：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司。

（8）磷酸二氫鉀：分析純，壽光市艾益農(nóng)生物科技有限公司。

（9）其他材料：塑封袋，記號筆，鏟子，藥匙，蒸餾水，報紙，橡皮筋，保鮮膜，標簽紙，馬鈴薯，利馬豆粉，75%酒精。

2.2 試驗儀器

（1）電子顯微鏡：XSP-8C，德卡精密量儀有限公司；

（2）電子天平：LTI000B，常熟市天量儀器有限責任公司；

（3）恒溫培養(yǎng)箱：BHIC-250，上海博迅實業(yè)有限公司；

（4）超凈工作臺：SW-CYJ1FDA，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

（5）高壓蒸汽滅菌鍋：GI5M4DS，致微儀器有限公司；

（6）冰箱：BCD-2651WBSV，上海帝覽實業(yè)有限公司；

（7）其他儀器：培養(yǎng)皿，取樣袋，酒精燈，濾紙，玻璃棒，燒杯，鑷子，接種環(huán)，試管，三角瓶，量筒。

2.3 試驗方法

2.3.1 培養(yǎng)基配備

參考周才碧[17]的方法，按試驗要求進行適當修改，具體方法如下：

（1）PDA培養(yǎng)基：洋芋400 g，葡萄糖40 g，瓊脂40 g，蒸餾水2000 mL。

（2）察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g，硝酸鈉2 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，磷酸二氫鉀1.0 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL。

2.3.2 菌株分離

（1）采集土壤：在貴州省都勻市三江堰茶園中，挑選優(yōu)質(zhì)土壤，用鏟子挖出，裝入密封袋中，用標簽紙貼好并編號，帶入實驗室以便制作菌種懸液。

（2）材料消毒：防止帶回土壤被周圍環(huán)境中的菌種污染，實驗操作要求在無菌條件下進行。提前2h把制備的培養(yǎng)基、實驗所用的工具和蒸餾水（制備稀釋濃度梯度的無菌水）放入高壓滅菌鍋中滅菌，以便使用。

（3）稀釋菌懸液：取20g土壤放入三角瓶中，裝入80mL的無菌水，搖晃 20min，制備菌種原懸液；再依次稀釋得到 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度梯度的菌種懸液。

（4）涂布接種：在酒精燈周圍，用接種環(huán)蘸取兩到三滴菌種懸浮液，使用涂布法在已經(jīng)配好的培養(yǎng)基中接種，并且將接種濃度用標簽紙在培養(yǎng)皿上做好記錄。實驗完成后，整理并關閉超凈工作臺，把已接種好的培養(yǎng)基放入25℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6-7d。直到有菌落形成時，就可以對菌株進行純化處理。

2.3.3 菌株純化

（1）準備工作：培養(yǎng)至第6d，已經(jīng)在培養(yǎng)基上可以明顯觀察到菌落。挑選培養(yǎng)基上生長旺盛的菌落，使用涂布平板劃線法進行進一步的純化處理。

（2）平板劃線法純化菌種：在超凈工作臺上進行劃線操作：首先在培養(yǎng)皿的底部用記號筆畫出五個區(qū)域，并標號。涂布劃線時注意在酒精燈周圍操作，先把接種環(huán)在酒精燈上灼燒2、3秒，等待接種環(huán)的溫度降低，可以把接種環(huán)放入培養(yǎng)基中等待降溫，防止較高的溫度殺死菌種。接著用接種環(huán)沾取菌，從標記的第I個區(qū)域開始劃線，畫出3、4條線后，用一定的角度連接著第Ⅰ個區(qū)域，繼續(xù)朝第Ⅱ個區(qū)域劃出3-4條線，接著再朝第三個區(qū)域畫線，以此類推。

2.3.4 菌株鑒定

在本試驗中對于菌株的檢測主要采用傳統(tǒng)的生物形態(tài)學鑒定法和ITS序列鑒定法。

（1）形態(tài)學鑒定的方法：

利用電子顯微鏡對菌種進行觀察并記錄菌種的相關特征，初步判斷該菌種的種類。被純化的菌種檢測出有25個孢子囊、分生孢子及厚垣孢子，根據(jù)記錄的優(yōu)勢菌種形態(tài)特征，先對比、分析出一類屬種。

生長速率的測定：在無菌環(huán)境下，把優(yōu)勢菌株打成直徑為5 mm的菌餅，轉(zhuǎn)移至條件為25℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d后，量取優(yōu)勢菌的直徑并再次記錄優(yōu)勢菌的特征。

（2）分子鑒定的方法：

①DNA的提取

利用優(yōu)勢種的菌絲，分步進行操作：a.研磨菌絲，加進500 μL裂解液，放置10 min；b.加入濃度是3M的KAC 150 μ L，經(jīng)離心（12000 rpm）15 min，取其上清；c.重復b，取上清液加入異丙醇，在12000 rpm條件下離心至15 min；d.取上清，加300 μL 70%的乙醇沉淀DNA，12000 rpm離心10 min，洗滌 4次；e.等水分散失，加 0.1×TE 30 μL，最終獲取液體狀態(tài)下的DNA。

②PCR擴增

引物是通用引物ITS4（5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3'，擴增體系的總體積是 25μL（DNA模板 1μL、10× buffer的緩沖液體 2.5μL、dNTPs 2μL、正引物1μL的體積、反向引物 1μL。Ex Taq DNA 聚合酶 0.125μL和ddH2O 17.4 μL），把體系中的不加菌株DNA提取物作為陰性對照，進行PCR擴增，擴增完成取出產(chǎn)物保存在4度冰箱，備用。

③電泳

a.制膠：稱 0.2 g瓊脂糖，加 20 mL的 0.5×TBE緩沖液（pH8.0），用微波爐加熱1.5 min，拿出瓊脂糖溶液，靜置一段時間，加1 μL Goldview指示劑，搖勻；插好梳子，穩(wěn)定模具，把凝膠倒入制膠模具。

b.電泳：將制膠板置于電泳槽中。取5 μL擴增產(chǎn)物加入2.5 μL溴酚藍，混勻后點樣。開啟設備，設定電壓（120 V）和時間（30 min）。

實驗結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中查看拍照并將PCR擴增產(chǎn)物送到華大基因生物技術(shù)有限公司測序。

④序列分析

把測序所得序列放到National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫Blast檢測，然后下載相應菌株序列。把所有菌株序列導入MEGA6.0軟件用多序列比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，肯定菌株種別。

2.4 數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物測序后提交到GenBank中，經(jīng)BLAST比對。

3 結(jié)果與分析

3.1 優(yōu)勢菌株的分離、純化

以優(yōu)質(zhì)土壤為材料，利用稀釋涂布分離得到5種菌；進一步利用平板劃線純化該菌株，最終得到優(yōu)勢菌株S3（詳見圖1），該菌株在25℃，PDA培養(yǎng)基中生長旺盛，生長周期較長。

3.2 目標菌株的鑒定

3.2.1 形態(tài)鑒定

利用傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定的方法，對3.1分離、純化得到的菌株S3進行觀察：利用電子顯微鏡觀察，優(yōu)勢菌種S3邊緣薄，中心有不規(guī)則狀的條紋，向上突起的菌絲在球形頂囊上分生出粗糙的孢子梗，孢子梗中長出許多分生孢子，具有足細胞。呈橄欖色，放射圓柱狀1-2節(jié)球狀，菌落大小4-8.5nm。根據(jù)菌株S3的菌落和孢子形態(tài)等特征，初步推斷該菌屬為青霉屬菌株（詳見圖 2）。

3.5.2 分子鑒定

提取菌株變幻青霉DNA，進行凝膠電泳及PCR擴增得到1條946 bp的清晰條帶（圖3），將此PCR產(chǎn)物測序后提交到GenBank中，經(jīng)BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，病原真菌的rDNA-ITS序列與Penicillium Variabile（HM469398）的序列相似度高達100%。依據(jù)比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4），表明該菌應歸為Penicillium Variabile。

結(jié)合形態(tài)學與分子生物學鑒定，確定從茶園土壤中分離純化出的菌為變幻青霉。

圖1 利用平板劃線純化出的優(yōu)勢菌S3

圖2 S3形態(tài)特征

圖3 S3 ITS擴增產(chǎn)物電泳圖

圖4 S3的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 結(jié)論與討論

4.1 討論

不同海拔、土壤、品種、樹齡、季節(jié)及管理方式，茶園土壤的優(yōu)勢菌株各異，且隨著土層的加深，真菌的種類和數(shù)量均逐漸減少；在茶園16目29屬39種微生物中，霉菌的種類最多[18-19]。本實驗取黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，并對其進行稀釋分離，將其樣品懸液涂布于培養(yǎng)皿培養(yǎng)得出多種菌種，又對菌種進行分離，再挑取菌種純化得到優(yōu)勢菌株S3。

為了明白優(yōu)勢菌株的背景，對于優(yōu)勢菌株S3的鑒定首要采取傳統(tǒng)的生物形態(tài)學鑒定法，利用電子顯微鏡觀察，初步推測該優(yōu)勢菌株S3為青霉屬菌株。青霉屬、曲霉屬和藍狀菌屬微生物均是土壤重要的腐生真菌，在不同地區(qū)和不同土壤類型都有廣泛分布，特別是熱帶或亞熱帶的磚紅壤、赤紅壤、紅壤、黃壤和燥紅土等酸性土壤[20]。為了研究優(yōu)勢菌株的背景、便于進一步開發(fā)該菌株，需進一步明確目標菌的種屬關系。經(jīng)過ITS序列分析，優(yōu)勢菌株S3與Penicillium Variabile（HM469398）的序列相似度高達100%。依據(jù)比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)合形態(tài)鑒定表明該菌應歸為變幻青霉Penicillium Variabile；該菌株在蘆葦根際土壤、山西歷山自然保護區(qū)土壤等[21-22]中均有發(fā)現(xiàn)，而在茶園土壤中為首次報道。

4.2 結(jié)論

本研究從優(yōu)質(zhì)土壤中稀釋培養(yǎng)出菌種，并通過分離、純化得到優(yōu)勢菌株S3；結(jié)合形態(tài)鑒定和分子鑒定可確定本次研究所得到的優(yōu)勢菌株S3為變幻青霉。

5 展望

目前，化學肥料的使用已經(jīng)有不同的危害，微生物是土壤的重要組成部分，在土壤中有至關重要的作用；利用有益微生物參與有機肥的配制，可調(diào)節(jié)速效與緩效養(yǎng)分、提高肥料利用率，減輕氮肥造成的硝酸鹽積累以及磷鉀肥造成的重金屬污染。但用變幻青霉作為生物有機肥的報道很少，對其是否有益于茶園土壤改善還有待于進一步研究。