胸苷酸合成酶和二氫嘧啶脫氫酶的表達與乳腺癌臨床病理特征及預后的相關性

迪麗拜爾·吾守，艾克白爾江·艾尼瓦爾，木合塔爾·吾布力卡斯木，祖麗比亞·司馬義，艾斯卡爾·艾沙

（喀什地區第二人民醫院1.普外科，2.科教部，3.急診外科，新疆 喀什844000）

5-氟尿嘧啶（5-FU）作為乳腺癌術后化療的常用藥物，可明顯提高患者生存時間，但患者對藥物敏感性和毒副反應存在個體差異，會影響化療效果［1-2］。胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）為5-FU的作用靶點，而二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD）為5-FU的分解代謝限速酶，這兩種酶的表達水平是影響5-FU療效的關鍵［3］。但目前有關兩者與乳腺癌相關性的研究較少。因此，本研究旨在探討TS和DPD表達與乳腺癌患者臨床病理特征和預后的相關性，以期為乳腺癌患者制定合理的個體化化療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

篩選2015年1月至2018年1月于喀什地區兩家三甲醫院乳腺外科行乳腺癌切除術的女性患者60例，年齡24～69歲，中位年齡49歲。乳腺癌組織學分類參考WHO乳腺腫瘤組織學分類（2003）標準，髓樣癌11例，浸潤性導管癌40例，浸潤性小葉癌9例。所有患者術前均未接受放療和化療，術后接收以5-FU為基礎的化療，收集的腫瘤組織及癌旁組織（腫瘤距離＞5 cm）樣本固定于10%中性多聚甲醛中，用于病理切片檢查。

1.2 試劑與儀器

單克隆鼠抗人TS抗體、多克隆兔抗人DPD抗體（英國Abcam公司）；山羊抗鼠、山羊抗兔IgG抗體（廣州市格瑞林生物科技有限公司）；LEICA RM2025組織切片機（德國Leica公司）；HD-330生物組織攤片烤片機（湖北慧達儀器有限公司）；KD-BM生物組織包埋機（北京佳源興業科技有限公司）；KL-R生物組織自動染色機（湖北康龍電子科技公司）。

1.3 免疫組化法檢測TS和DPD蛋白的表達

將腫瘤組織和癌旁組織石蠟包埋后，制作厚度4μm的切片，60℃烤片1～1.5 h，二甲苯浸泡脫蠟，梯度乙醇水化，修復抗原［高壓鍋加入0.01mol／L枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH 6.0），鍋蓋不鎖定，緩慢加壓，5 min后鎖定鍋蓋，10 min后除去熱源，自來水沖洗降溫］，3%H2O2室溫孵育10 min，10%胎牛血清封閉10min，加入TS或DPD抗體（TS1∶20，DPD 1∶100）4℃孵育過夜，山羊抗鼠或抗兔IgG抗體室溫孵育20 min，鏈霉素 辣根過氧化物緩沖液孵育20 min，二氨基聯苯胺染色。中性樹脂封片后，顯微鏡下觀察TS和DPD蛋白的表達。

1.4 結果評價

100×視野下觀察細胞著色，著色部位主要集中于細胞質，根據著色面積和強度進行綜合評價，著色面積為無著色、≤25%、25%～50%、≥50%分別記0、1、2、3分；著色強度為無著色、低度著色、中度著色、高度著色分別記 0、1、2、3分；計算兩項計分之和，≤2分為陰性表達，＞2分為陽性表達。

1.5 統計學分析

采用SPSS 11.0軟件進行統計分析，數據結果以頻數或率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義；并采用了多因素回歸分析，研究年齡、腋下淋巴結轉移、TS以及DPD的蛋白表達與喀什地區乳腺癌患者預后的相關性。

2 結果

2.1 乳腺癌組織和癌旁組織TS和DPD的表達

免疫組化染色結果顯示，60例乳腺癌癌組織中TS和DPD蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁組織（P均＜0.05）。見圖1和表1。

表1 乳腺癌癌組織和癌旁組織中TS和DPD的表達例，n＝60

2.2 腫瘤組織中TS和DPD表達與臨床病理特征的關系

由表2可知，乳腺癌腫瘤組織中TS表達與臨床分期、組織分化程度和淋巴結轉移顯著相關（P＜0.01或P＜0.05），而與年齡、腫瘤直徑和組織學分類無相關性（P均＞0.05）。DPD表達僅與淋巴結轉移顯著相關（P＜0.05），而與年齡、腫瘤直徑、臨床分期、組織分化程度和組織學分類無相關性（P均＞0.05）。

表2 乳腺癌組織中TS和DPD表達與臨床病理特征的關系

2.3 TS、DPD的表達與患者生存時間的關系

Kaplan-Meier分析結果顯示，TS陽性表達的乳腺癌患者生存時間比陰性患者明顯縮短（χ2＝4.502，P＝0.034），而 DPD表達與患者生存時間無顯著相關性（χ2＝0.417，P＝0.519）。TS陰性患者5年存活率為72.73%，明顯高于陽性組（51.82%，χ2＝4.355，P＝0.037）；DPD陰性和陽性表達患者 5年存活率分別為67.35%和72.34%，差異無統計學意義（χ2＝0.284，P＝0.594）。見圖 2。

為了進一步驗證腫瘤組織中TS和DPD表達與生存時間的關系，本研究又采用了多因素回歸分析。結果顯示，年齡、腋下淋巴結轉移、TS以及DPD的回歸系數均為正值，表明4者與術后生存率呈負相關，與死亡率呈正相關，是危險因素，即年齡大、發生腋下淋巴結轉移、TS蛋白表達高者生存期短，4者是獨立的預后因素。根據相對危險度，TS對預后的影響最大，其次為淋巴結轉移。見表3。

圖2 乳腺癌組織中TS和DPD表達與生存時間的關系

3 討論

TS是催化尿嘧啶脫氧核苷甲基化為胸腺嘧啶脫氧核苷的限速酶，而胸腺嘧啶脫氧核苷是合成和修復DNA所必需的，在細胞生長過程中發揮重要作用［4］。DPD是一類二聚體蛋白酶，主要參與催化嘧啶核苷酸的分解代謝，同時也是氟尿嘧啶類抗腫瘤藥物體內分解代謝的起始和限速酶［5］。5-FU、替加氟、替吉奧、卡培他濱等都屬于氟尿嘧啶類藥物，而后3種藥物在體內發揮抗腫瘤作用的有效成分均為5-FU［6］。5-FU作為一種嘧啶衍生物，其代謝產物能與TS結合并抑制其活性，遏制胸腺嘧啶脫氧核苷的從頭合成，引發細胞核酸代謝紊亂，從而造成腫瘤細胞死亡［7］。

表3 60例乳腺癌患者多因素預后分析

近年來，關于多種腫瘤組織中TS和DPD表達與腫瘤臨床病理參數、5-FU化療敏感性及預后等方面的研究較多，但研究結果存在爭議。目前還缺乏大規模臨床試驗進行驗證［8-10］。國內余之剛等［11］的研究顯示，TS與胸腺嘧啶脫氧核苷磷酸化酶表達水平的高低有可能是乳腺癌患者一個重要的預后指標；而DPD的表達與臨床病理因素、10年無病生存和總生存率之間無任何相關性。Horiguchi等［10］對浸潤性乳腺癌組織中DPD表達的研究顯示，與DPD陰性表達患者相比，DPD陽性表達患者的生存預后較差，并且DPD還可作為5-FU或5-FU衍生物治療患者的預后因子。但是，Hakamada等［12］對5-FU化療的乳腺癌患者的研究表明，腫瘤組織中DPD表達與患者5年生存率無顯著性相關。在本研究中，腫瘤組織中DPD陽性表達亦顯著高于癌旁組織，但其表達僅與淋巴結轉移顯著相關（P＜0.05），而與腫瘤直徑、臨床分期、組織分化程度、生存時間和5年存活率等均無相關性；而TS蛋白水平不僅顯著高于癌旁組織，而且還與臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移、生存時間以及5年存活率顯著相關。這與Yu等［13］的研究結果基本一致。

本研究中多因素回歸分析結果顯示，年齡、腋下淋巴結轉移、TS以及DPD的表達均與患者的預后相關，并且TS對預后的影響最大，其次為淋巴結轉移，而DPD對乳腺癌患者預后的影響最小。

綜上所述，乳腺癌組織中TS和DPD陽性表達異常增加，均具有作為乳腺癌輔助診斷指標的可能性，但DPD表達僅與乳腺癌轉移顯著相關，而TS與乳腺癌多種臨床病理特征和預后顯著相關。所以TS表達可能具有成為5-FU化療對乳腺癌療效的預測參數的潛力，甚至作為乳腺癌臨床預后的預測因子。但由于本研究中的樣本量偏少，為保證研究的可靠性和科學性，下一步還需要收集更多的樣本進行研究。