帕金森病理機制常談常新：多巴胺能神經(jīng)的氧化性死亡
——ferroptosis和oxytosis＊

段文君，李怡芳，栗原博，何蓉蓉

（1.暨南大學(xué)廣東省疾病易感性及中醫(yī)藥研發(fā)工程技術(shù)研究中心 廣州 6125052；2.暨南大學(xué)廣東省中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和創(chuàng)新藥物研究重點實驗室 廣州 6125052；3.暨南大學(xué)藥學(xué)院，中藥及天然藥物研究所 廣州 6125052）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）也稱為震顫麻痹，是一種以黑質(zhì)致密部神經(jīng)元的死亡為特征的慢性進行性神經(jīng)退行性疾病。臨床上常用行為功能的異常作為診斷PD的指標(biāo)，主要包括動作遲緩、僵硬、靜止性震顫、姿勢不穩(wěn)，且隨病情發(fā)展，不對稱地由一側(cè)發(fā)病發(fā)展為雙側(cè)發(fā)病。PD主要的病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損傷和神經(jīng)元內(nèi)路易小體的出現(xiàn)，這也是臨床診斷和治療PD患者的重要依據(jù)。

目前研究認(rèn)為凋亡（apoptosis）、程序性壞死（necroptosis）和自噬性死亡（autophagic death）等死亡方式都參與了多巴胺能神經(jīng)元的死亡[1]。但是，這些死亡方式都不足以解釋其病理進程和機制，深入研究發(fā)現(xiàn)這些死亡方式都存在一個共同特征，即：多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷。最新的研究也表明，中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的脂質(zhì)過氧化是PD重要發(fā)病機制[2]，而真正可能反應(yīng)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的細(xì)胞死亡方式或許是近些年新發(fā)現(xiàn)的ferroptosis（暫譯名：鐵死亡）[3]。這種細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為線粒體嵴消失，線粒體變小，膜密度增加，細(xì)胞變小變圓且相互之間分離，生物化學(xué)特征表現(xiàn)為脂質(zhì)活性氧（reactive oxidative species，ROS）累積，谷胱甘肽（gluta?thione，GSH）耗竭，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPx4）抑制，多不飽和脂肪酸釋放增加等，因其在形態(tài)學(xué)、基因?qū)W、生物化學(xué)特征上與傳統(tǒng)的死亡方式均有明顯的不同，并且依賴細(xì)胞內(nèi)的鐵，而不是其他金屬，所以命名為ferroptosis[4,5]。此外，大約30年前在神經(jīng)細(xì)胞里發(fā)現(xiàn)了一種涉及GSH減少、ROS產(chǎn)生增加、脂氧合酶活化和鈣內(nèi)流的細(xì)胞死亡途徑[6]，并最終被命名為oxytosis（暫譯名：氧化凋亡）[7]。這兩種死亡方式在特征和信號調(diào)節(jié)等方面都有著高度相似性，最新的研究指出ferroptosis和oxytosis可能是同一種細(xì)胞死亡方式[8]。在這篇綜述中，我們討論了這兩種高度相關(guān)的程序性細(xì)胞死亡途徑，并總結(jié)了目前它們與神經(jīng)元死亡相關(guān)的研究進展。

1 多巴胺能神經(jīng)元退行性死亡是帕金森病的主要病理機制

PD患者的神經(jīng)病理學(xué)診斷需要檢測黑質(zhì)部位神經(jīng)元的損傷或死亡、路易小體和路易神經(jīng)突的出現(xiàn)[9]。路易小體是嗜酸性的包涵體，電鏡下觀察其有一個致密核，周圍環(huán)繞一圈蒼白色輻射狀的纖絲樣光暈[10]。錯誤折疊的α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）是路易小體的輻射狀光暈的重要組成成分，存在于突觸前末端，負(fù)責(zé)維持突觸囊泡儲備池的正常功能，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[11-13]。正常的α-syn主要以單體構(gòu)型（14kDa）存在，并處于單體和聚合體的平衡狀態(tài)[14]。在特定應(yīng)激條件下，例如氧化應(yīng)激[15]、翻譯后修飾[16,17]、蛋白水解[18,19]、脂肪酸的濃度[20,21]、磷脂和金屬離子[22]都可能誘使它形成穩(wěn)定的多聚體和其他不同構(gòu)型。在PD患者和轉(zhuǎn)基因α-syn動物模型的腦部中多個區(qū)域發(fā)現(xiàn)α-syn的異常分布和聚集，被認(rèn)為是多巴胺釋放異常的原因之一[23,24]。體內(nèi)和體外的實驗數(shù)據(jù)都證明原纖維化的低聚體是α-syn毒性形式之一，它能改變生物膜的通透性引起鈣離子內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞死亡，通過損傷線粒體引發(fā)溶酶體泄露，損傷微管，以及與軸突轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白相互作用，導(dǎo)致突觸功能異常[25-27]。最近的研究認(rèn)為，持續(xù)的多巴胺能神經(jīng)元損傷依賴于低聚化的α-syn向纖維化的轉(zhuǎn)變[28]。此外，過表達的α-syn抑制多巴胺合成過程的限速酶，酪氨酸羥化酶的基因表達和蛋白活性[29]。

氧化應(yīng)激一直是解釋帕金森病多巴胺能神經(jīng)元損傷的基石。從20世紀(jì)八十年代開始，越來越多的文章報道稱，無論誘發(fā)神經(jīng)元死亡的誘因是什么，ROS的形成都是關(guān)鍵的一步，是神經(jīng)元損傷或死亡的較為本質(zhì)的原因[30,31]。在帕金森病患者的黑質(zhì)致密部甚至全身都能夠檢測到脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA的氧化[31-33]。黑質(zhì)部位鐵含量、鈣離子通道活性和蛋白水解功能的改變，以及α-syn的堆積和突變蛋白的出現(xiàn)，都與氧化應(yīng)激有關(guān)[34-37]。盡管通過控制氧化應(yīng)激可以緩解體內(nèi)和體外的帕金森病模型的病程發(fā)展，但是單純依靠清除ROS的治療手段在臨床研究中的應(yīng)用暫時尚未獲得成功。目前對于ROS的來源還存在爭議，或來自于神經(jīng)元，或來自神經(jīng)膠質(zhì)，但可以達成一致的是ROS的產(chǎn)生始于線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[30]。基于線粒體的神經(jīng)細(xì)胞死亡可以解釋家族遺傳性以及零散發(fā)生的帕金森病。MPTP的活性代謝物MPP+、魚藤酮和番荔枝素都通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用，在帕金森病患者體內(nèi)也能檢測到這種抑制作用，同時三羧酸循環(huán)中酮戊二酸脫氫酶也有損傷，表明線粒體呼吸鏈復(fù)合物I受損是帕金森病的發(fā)病類型之一[38-40]。家族發(fā)病的遺傳學(xué)研究顯示，α-syn、parkin、PINK1、DJ-1和LRRK2的表達或活性異常都與線粒體功能障礙有關(guān)[9,34,41]。

在多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞膜上，多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)代謝旺盛，產(chǎn)生神經(jīng)毒性代謝物多巴胺醌和6-羥基多巴胺（6-OHDA）[42]，這極有可能是多巴胺能神經(jīng)元對氧化應(yīng)激非常敏感的主要原因[43]。多巴胺醌是主要代謝產(chǎn)物，環(huán)化形成無色多巴胺色素并緩慢氧化為神經(jīng)黑素單體。醌類化合物通過將蛋白質(zhì)巰基和胺基團烷基化以及在ROS和GSH二硫化物的存在下促進蛋白質(zhì)氧化來傳遞毒性[44]。這些蛋白質(zhì)的生物化學(xué)異常將導(dǎo)致功能障礙，并破壞細(xì)胞膜的完整性，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。6-OHDA也是線粒體復(fù)合物I和IV的有效抑制劑，并且可能被鐵進一步氧化成反應(yīng)性半醌[38]。此外，6-OHDA的代謝還產(chǎn)生過氧化氫，其參與與亞鐵離子的Fenton反應(yīng)，通過形成羥基自由基來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致DNA加合物形成、脂質(zhì)過氧化、膜完整性喪失以及細(xì)胞凋亡[45]。

2 多巴胺能神經(jīng)元ferroptosis死亡方式可能是帕金森病的新病理機制

Ferroptosis是在開發(fā)治療腫瘤的藥物的過程中新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式[46]。2012年Dr.Brent R.Stockwell及其團隊首次發(fā)現(xiàn)小分子erastin能誘導(dǎo)選擇性致死原癌基因Ras的細(xì)胞發(fā)生一種明顯不同于凋亡、壞死和自噬的鐵依賴性的細(xì)胞死亡方式，主要通過誘導(dǎo)由鐵依賴的脂質(zhì)過氧化累積而殺傷細(xì)胞或損害細(xì)胞功能[3,5]，具有線粒體皺縮和膜密度增加的獨特細(xì)胞死亡形態(tài)[3,47]。Ferroptosis可以被兩類小分子化合物誘導(dǎo)：一類是谷氨酸胱氨酸轉(zhuǎn)運體xc-系統(tǒng)（一種最初由Bannai和Kitamura[48]提出的胱氨酸谷氨酸反向轉(zhuǎn)運蛋白）抑制劑；另一類是GPx4抑制劑[49]。除了這些小分子物質(zhì)以外，還有許多藥物（例如：索拉菲尼、青蒿素及其衍生物）也可以誘導(dǎo)ferroptosis[49]。活化的線粒體電壓依賴性陰離子通道、絲裂原激酶MAPK、上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和抑制細(xì)胞膜xc-系統(tǒng)是誘導(dǎo)細(xì)胞ferroptosis的主要原因[47,50,51]，其主要機制在于誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物的生成和ROS的堆積。而這種堆積很大程度上能夠被一些鐵螯合劑（去鐵胺、去鐵敏）和脂質(zhì)過氧化抑制劑（ferrostatin、lipeoxstatin、齊留通）所抑制[3,52,53]。GPx4、熱休克蛋白HspB1，核因子E2相關(guān)因子Nrf2能夠通過抑制鐵離子攝取和抑制ROS生成來負(fù)向調(diào)節(jié)ferropto?sis進程[54,55]。另一方面，NADPH氧化酶、p53等則能夠通過促進ROS的生成和抑制SLC7A11（胱氨酸、谷氨酸轉(zhuǎn)運離子通道主要配體）的表達來誘導(dǎo)ferroptosis的發(fā)生[56,57]。同時，多種代謝途徑如甲羥戊酸、轉(zhuǎn)硫以及谷氨酰胺途徑等，對ferroptosis的調(diào)控也起著至關(guān)重要的作用[58,59]。Ferroptosis已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)參與到很多人類疾病的病理和生理進程之中，包括腫瘤、神經(jīng)毒性、神經(jīng)退行性疾病、急性腎損傷、藥物誘導(dǎo)的肝臟損傷、肝臟/心臟缺血再灌注損傷、T細(xì)胞免疫等[49]。

2.1 Ferroptosis在帕金森病中研究進展

Ferroptosis的主要特征為依賴鐵離子的脂質(zhì)過氧化損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，同時其調(diào)節(jié)機制主要圍繞GSH的合成及GSH過氧化物酶活性來展開。在目前已經(jīng)研究的多種PD模型中都發(fā)現(xiàn)可能有ferroptosis參與其中，ferroptosis在MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型中發(fā)揮作用，給予ferrostatin-1能有效的保護MPTP和魚藤酮所帶來的多巴胺能神經(jīng)元死亡[60]。但是結(jié)合之前的科學(xué)研究和ferroptosis的調(diào)控機制，我們不難發(fā)現(xiàn)，谷氨酸鹽神經(jīng)毒性、大腦的鐵負(fù)荷以及GPx4缺失所誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化可能都會以誘導(dǎo)ferroptosis的方式影響PD病理進程。總結(jié)PD研究中可能涉及ferroptosis調(diào)節(jié)機制，能夠?qū)erroptosis在PD中的作用研究形成借鑒。

在誘導(dǎo)ferroptosis的體外實驗中，給予小分子erasin可以抑制胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白（xCT），進而阻斷細(xì)胞對胱氨酸的攝取并引起細(xì)胞發(fā)生ferroptosis[3]。胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，這是GSH合成的限速前體。當(dāng)xCT被抑制時，胱氨酸攝取減少，導(dǎo)致GSH合成水平降低；GSH過氧化物酶如GPx4消耗GSH并清除過氧化氫和磷脂氫過氧化物[4]。GSH也是LIP中亞鐵離子的天然配體[61]，LIP是神經(jīng)元內(nèi)相對游離的鐵離子的交換池。GSH在LIP中與鐵離子的結(jié)合可以防止亞鐵被氧化，一方面保持鐵離子的溶解度（三價鐵是高度不溶的），另一方面抑制亞鐵作為把潛在氧化物如羥自由基變成過氧化氫的催化劑。谷胱甘肽的耗盡釋放鐵離子從而產(chǎn)生羥自由基，由此引起ferroptosis中所觀察到的脂質(zhì)過氧化。

除了erasin外，RSL3通過結(jié)合GPx4并使其失活而觸發(fā)ferroptosis[4]。因此，給予erasin和RSL3均可引起脂質(zhì)過氧化[3,4]。此外，采用插入誘變篩選了兩個涉及脂質(zhì)代謝的基因，酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）和溶血磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶3（LpCAT3），是依賴于GPx4失活的ferroptosis所必需基因[62]。繼而有研究證實ACSL4是前ferroptosis基因，而且是GPx4失活后脂質(zhì)過氧化發(fā)生的關(guān)鍵基因[63]。此外，敲除AC?SL4表達減少了磷脂酰乙醇胺以及花生四烯酸和腎上腺素的的量，降低了細(xì)胞對ferroptosis敏感性[63]。

Ferroptosis是鐵離子依賴的細(xì)胞死亡方式，同時PD患者或模型的大腦中也發(fā)現(xiàn)了大量鐵離子的聚集。目前的研究表明，鐵負(fù)荷能夠以多種方式誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的死亡：①通過Fenton反應(yīng)誘導(dǎo)大量的ROS生成[64]；②激活MAO-B活性，誘導(dǎo)多巴胺氧化和更多內(nèi)源性ROS的生成[65]；③多巴胺代謝產(chǎn)物可以與鐵離子和過氧化氫反應(yīng)生成神經(jīng)毒性化合物，6-OHDA[66]；④鐵離子可以增加PD的標(biāo)志物，α-syn的纖維化和聚集[67]。雖然目前還沒有研究報道α-syn涉及到多巴胺能神經(jīng)元ferroptosis的死亡進程，但是其與鐵負(fù)荷之間的關(guān)聯(lián)已早有報道。α-Syn對鐵離子和亞鐵離子都有較強的親和力，而且這兩種形式的鐵離子在體外被證明能夠加速α-syn的聚集，給予鐵螯合劑后則能顯著抑制這種現(xiàn)象的發(fā)生[68,69]。同時α-syn還可以作為鐵離子的還原劑，能夠?qū)㈣F離子還原為二價鐵離子，從而加重了神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的鐵負(fù)荷和ferroptosis所依賴的ROS的產(chǎn)生[68]。鐵反應(yīng)元件（IRE）是細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯以調(diào)節(jié)神經(jīng)元鐵負(fù)荷的關(guān)鍵位點，目前已經(jīng)證明了α-syn mRNA的5’端的非翻譯編碼區(qū)是一個潛在的IRE[70]。這就意味著鐵離子濃度的增加可能通過與IRE的結(jié)合進一步誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)α-syn的表達增加來損傷神經(jīng)元。在一項研究中這個觀點也得到了證實，鐵離子的耗竭能夠減少α-syn的表達[71]。α-Syn還能與維持細(xì)胞內(nèi)鐵離子穩(wěn)態(tài)的蛋白進行病理性相互作用，在MPP+處理的神經(jīng)纖維瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，抑制了在鐵離子攝入和ferroptosis中其重要調(diào)節(jié)作用的蛋白（鐵離子轉(zhuǎn)運受體1）TfR1后，能夠顯著的減少α-syn的表達和聚集[72]。這些研究都能表明α-syn與細(xì)胞內(nèi)鐵負(fù)荷具有直接的相互作用，預(yù)示著他們在PD的病理調(diào)節(jié)中具有共同的調(diào)節(jié)途徑，比如說ferroptosis。

2.2 Ferroptosis信號通路蛋白在帕金森病中的調(diào)節(jié)作用

鐵螯合作用能夠逆轉(zhuǎn)erasin誘導(dǎo)的ferroptosis[3,52]，表明鐵離子是細(xì)胞死亡途徑的必要介體。容易發(fā)生ferroptosis的細(xì)胞中上轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR1是上調(diào)的，TfR1與轉(zhuǎn)鐵蛋白形成鐵離子吸收的復(fù)合物，并下調(diào)參與細(xì)胞內(nèi)鐵離子儲存的鐵蛋白的表達[52]。抑制ferrop?tosis的藥物包括ferrostatin-1、去鐵酮、N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和 liproxstatin-1[60,73]。Ferrostatin-1和liproxstatin-1通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來防止ferroptosis[73,74]。鐵螯合劑去鐵酮通過抑制鐵離子蓄積來逆轉(zhuǎn)細(xì)胞ferroptosis死亡[60]，而NAC則通過提高細(xì)胞內(nèi)GSH水平來防止ferroptosis的發(fā)生[4]。

前人對ferroptosis信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子的研究顯示其有幾種因子確實參與到了PD的病理進程中，鐵離子在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中的富集是PD的主要特征[75]。作為強還原劑，鐵離子負(fù)荷能夠?qū)е麓罅苛u基自由基的生成并誘導(dǎo)多巴胺的氧化，這可能造成了細(xì)胞內(nèi)的氧化微環(huán)境并導(dǎo)致黑子多巴胺能神經(jīng)元的損傷和丟失[76]。而且導(dǎo)致鐵離子代謝失衡的基因突變常常會導(dǎo)致PD的發(fā)生，進一步證明了鐵離子含量升高在PD病理進程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。幾種涉及到細(xì)胞鐵攝取和轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)的突變也跟PD相關(guān)。Borie等人[77]的研究表明轉(zhuǎn)鐵蛋白的突變跟增加PD的風(fēng)險有關(guān)。這些預(yù)示著鐵攝取機制在這些帕金森患者中過度活躍，并導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)的鐵富集。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR2蛋白的突變在PD中起到保護作用，可能跟其能減少細(xì)胞內(nèi)鐵攝取并降低鐵的富集有關(guān)。神經(jīng)元內(nèi)的鐵離子轉(zhuǎn)運出去都要通過膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白，淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）能夠在膜上穩(wěn)定膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的表達，保證細(xì)胞內(nèi)鐵離子的轉(zhuǎn)出并減少鐵累積。APP幾種罕見突變以及幾項AD家族史的研究表明APP的突變與PD有關(guān)[78]。血漿銅藍蛋白能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的二價鐵轉(zhuǎn)化成三價鐵并以轉(zhuǎn)鐵蛋白的形式儲存或轉(zhuǎn)運出細(xì)胞，而其編碼基因的突變也跟PD有關(guān)[79]。鐵轉(zhuǎn)出功能缺陷對PD的影響在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中也得到了驗證，APP表達降低會導(dǎo)致神經(jīng)元大量丟失，并增加細(xì)胞內(nèi)血漿銅藍蛋白的表達水平。氧化應(yīng)激對帕金森進程的影響已經(jīng)有多種研究，脂質(zhì)過氧化在PD患者的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中已經(jīng)被檢測出來，而且其能夠促進神經(jīng)元的退行性病變[80]。谷胱甘肽水平在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中水平顯著降低也是PD病理進程中早期的標(biāo)志[76]。

2.3 Ferroptosis抑制劑在帕金森病中具有潛在的保護作用

多巴胺能神經(jīng)元中氧化代謝活動頻率極高，但是其細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶體活力低，且富含能夠催化氧化還原反應(yīng)的鐵，因而對氧化應(yīng)激特別敏感。其內(nèi)豐富的多巴胺也能夠通過酶解代謝和非酶代謝產(chǎn)生毒性極大的活性氧[81]。目前的研究表明，鐵負(fù)荷是PD中較為容易處理的靶標(biāo)。在多巴胺能前體衍生的神經(jīng)元細(xì)胞系LUHMES細(xì)胞中施用ferroptosis抑制劑、鐵螯合劑去鐵酮和NAC，能緩解erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，而凋亡和自噬抑制劑則不能起到保護作用[60]。此外，LUHMES細(xì)胞中的多巴胺毒性可以通過ferroptosis抑制劑所緩解，而增加多巴胺表達則加劇erastin毒性，暗示著多巴胺能神經(jīng)元可能固有地對ferroptosis敏感。這也就解釋了為什么鐵和多巴胺的富集會增加多巴胺能神經(jīng)元變性的脆弱性[42]。在離體器官培養(yǎng)種，用erastin能夠顯著的增加大腦紋狀體內(nèi)細(xì)胞的丟失，并且ferroptosis的抑制劑ferrostatin-1能夠顯著的緩解MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，而且在MPTP處理前24小時注射小鼠ferro?statin-1可以顯著挽救小鼠的行為障礙和神經(jīng)元損失[60]，這表明在動物模型中常見的PD相關(guān)毒素引起神經(jīng)變性的機制有可能是ferroptosis。在細(xì)胞培養(yǎng)和MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型中給予鐵螯合劑，如去鐵酮等處理，會減少細(xì)胞內(nèi)的ROS生成，增加多巴胺的利用率，從而改善現(xiàn)有的運動能力和抑制運動神經(jīng)元的功能惡化[82]。在一組PD患者的研究中，給予18個月的去鐵酮治療可以顯著的緩解早期帕金森癥狀并減緩運動缺陷的進展，在三期臨床試驗中能夠重復(fù)這一結(jié)果，證明了鐵在PD中的關(guān)鍵作用[83]。隨后的研究觀察發(fā)現(xiàn)，使用去鐵酮六個月的PD患者大腦增加了多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)GSH含量，而GSH的合成前體NAC，已經(jīng)進入PD治療的三期臨床試驗[84]。另外，此前發(fā)現(xiàn)一類格列酮的化合物能夠選擇性的抑制ferroptosis信號通路中參與磷脂代謝和膜磷脂合成的酶ASCL4[85]。這類化合物能夠顯著的減少糖尿病病人中PD的發(fā)病概率，并且其已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了能夠協(xié)同liproxstatin-1抑制細(xì)胞ferroptosis的發(fā)生[63]，暗示著其作為PD藥物開發(fā)的前景。

3 Ferroptosis和oxytosis可能是同一種非凋亡程序性細(xì)胞死亡

1988年，來自Coyle's團隊的Murphy及其同事報道稱，在N18-RE-105神經(jīng)母細(xì)胞瘤X視網(wǎng)膜細(xì)胞系中，谷氨酸鹽以及谷氨酸鹽類似物使君子氨酸和鵝膏蕈氨酸誘導(dǎo)一種鈣依賴的細(xì)胞延遲死亡的形式[6]。由于這種細(xì)胞的死亡類型被低胱氨酸培養(yǎng)基（一種GSH前體）加劇，因此推測其與細(xì)胞內(nèi)GSH的消耗有關(guān)，其特征在于氧化應(yīng)激的增加，并且能被親脂抗氧化劑所抑制[86]。研究證明谷氨酸介導(dǎo)的對胱氨酸攝取的抑制是谷氨酸暴露和GSH消耗之間的關(guān)聯(lián)性機制[86]。在這一點上，負(fù)責(zé)谷氨酸抑制性的胱氨酸攝取的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)與胱氨酸谷氨酸反向轉(zhuǎn)運xc-系統(tǒng)具有高度相似之處。研究表明，這種細(xì)胞死亡的類型與GSH消耗后ROS生成的顯著增加有關(guān)，隨后鈣內(nèi)流導(dǎo)致最終的細(xì)胞死亡[7]。2001年，這種新的非凋亡的程序性細(xì)胞死亡被命名為oxytosis，該名稱突出了這種類型的細(xì)胞死亡的特征為ROS堆積，并強調(diào)它是一種不同于細(xì)胞凋亡的程序性細(xì)胞死亡[7]。

抑制細(xì)胞對胱氨酸的攝取是大多數(shù)oxytosis的實驗?zāi)Ｊ街械年P(guān)鍵起始步驟。胱氨酸可通過四種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入細(xì)胞：興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白（EAAT）[87]、b0,+系統(tǒng)（rBAT與SLC7A9的異二聚體[88]）、介導(dǎo)天冬氨酸、谷氨酸和胱氨酸反向轉(zhuǎn)運的rBAT與AGT1/SLC7A13異二聚體[89]，以及xc-系統(tǒng)[90]。使用底物抑制劑如氨基己二酸鹽、高半胱氨酸鹽和使君子氨酸從藥理方面抑制xc-系統(tǒng)[6,86]或從xCT敲除小鼠提取從基因方面抑制xc-系統(tǒng)的細(xì)胞[91]均可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，表明胱氨酸攝取抑制引起的xc-系統(tǒng)的抑制與oxytosis的發(fā)生有關(guān)。然而，除了胱氨酸饑餓或抑制胱氨酸攝取外，使用谷胱甘肽半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，GCL，GSH生物合成中的限速酶）抑制劑丁基硫酸亞砜抑制GSH的合成，可誘導(dǎo)oxytosis的發(fā)生[90]。而在xCT的高表達的情況下，胱氨酸/半胱氨酸可以彌補GSH的缺失[92,93]。

Ferroptosis的誘導(dǎo)劑erastin[3]就是一個xc-系統(tǒng)抑制劑[51]，并且通過由xc-系統(tǒng)抑制而導(dǎo)致的旁路半胱氨酸耗盡可以逆轉(zhuǎn)erastin誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的變化[51,91]。從兩種細(xì)胞死亡方式在脂氧合酶、GPx4、ROS這幾方面的變化特性可以得出一個合理的假設(shè)：ferroptosis和oxytosis代表著非常相似（或甚至相同）形式的程序性細(xì)胞死亡。許多研究表明，ferroptosis和oxytosis的發(fā)生都依賴于脂氧合酶的活性，引起ROS大量產(chǎn)生并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。盡管涉及的具體的脂氧合酶種類可能取決于細(xì)胞類型，但目前的數(shù)據(jù)均表明GSH的耗盡導(dǎo)致脂氧合酶的活化，繼而與PEBP1相互作用并與膜（特別是細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器膜）結(jié)合，傳遞脂質(zhì)ROS、氧化磷脂酰乙醇胺（包括花生四烯酸或腎上腺酸），而形成細(xì)胞死亡[5,94,95]。GPx4的失活最終導(dǎo)致的結(jié)果與脂氧合酶活化相同：生物膜內(nèi)部小葉中脂質(zhì)ROS的堆積。在體外xc-系統(tǒng)抑制時，GSH耗盡導(dǎo)致脂氧合酶的活化和GPx4的失活，兩者均參與了ferroptosis和oxytosis進程。另外，由于脂氧合酶的活化需要將其二價鐵氧化為三價鐵，因此這兩種途徑可能是相互關(guān)聯(lián)的。磷脂過氧化氫在GPx4抑制作用下的堆積，有利于脂氧合酶的活化[5,94,96]。ROS，特別是脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，是ferroptosis和oxytosis的細(xì)胞級聯(lián)式死亡中的重要步驟。不同來源的ROS對不同細(xì)胞類型的作用可能不盡相同。線粒體來源的非脂質(zhì)ROS似乎繼發(fā)于脂質(zhì)過氧化氫的產(chǎn)生，后者極有可能因脂氧合酶的活化而產(chǎn)生[97]。目前還不清楚脂氧合酶誘導(dǎo)的線粒體外膜改變是否直接誘導(dǎo)線粒體來源的非脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生。在GPx4基因缺失的MEFs細(xì)胞和谷氨酸誘導(dǎo)oxytosis的HT22細(xì)胞中，ferroptosis抑制劑ferrostatin-1、liprox?statin-1以及1,8-tetrahydryaphthyridinol衍生物能夠通過捕獲過氧化自由基鏈而保護細(xì)胞免于死亡[98]，這些作用表明脂質(zhì)過氧化氫是ferroptosis和oxytosis細(xì)胞死亡中重要起始因素。

有研究提到維生素E家族的生育三烯酚可通過減少oxytosis，預(yù)防包括PD在內(nèi)的一些神經(jīng)退行性疾病（阿爾茨海默病、亨廷頓病等），但并未作深入的機制探討[99]。早在2007年Xu等人[100]在小鼠海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞的谷氨酸毒性模型中發(fā)現(xiàn)oxytosis的產(chǎn)生，程序性壞死抑制劑necrostatin-1能通過上調(diào)GSH水平并減少活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生而發(fā)揮細(xì)胞保護作用。2018年同樣是在HT-22細(xì)胞中，Hirata等人[101]發(fā)現(xiàn)了一種新化合物GIF-0726-r，可以防止谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，包括ferroptosis和oxytosis。盡管目前還沒有確切的有關(guān)oxytosis在PD發(fā)病機制中的研究，但基于fer?roptosis和oxytosis在信號調(diào)節(jié)等方面的高度一致性，可以認(rèn)為新近探討的ferroptosis與PD發(fā)病機制的關(guān)系與oxytosis的作用差別無二。

4 中藥抗ferroptosis在PD藥物開發(fā)方面的應(yīng)用前景

在我國，中藥具有幾千年的應(yīng)用歷史，并且大部分是安全、有效的天然藥物，含有多種活性成分。最近的研究表明發(fā)現(xiàn)黃芩素（baicalein）可抑制胰腺癌細(xì)胞中麥角菌素誘導(dǎo)的 ferroptosis，與 ferrostatin-1、liprox?statin-1、甲磺酸去鐵胺和β-巰基乙醇等ferroptosis抑制劑相比，黃芩素具有顯著的抗ferroptosis活性。黃芩素可以抑制麥角菌素誘導(dǎo)的二價鐵生成、谷胱甘肽的消耗和脂質(zhì)過氧化，并且抑制erastin誘導(dǎo)的GPx4的降解[102]。Probst等[103]發(fā)現(xiàn)黃芩素可作為選擇性12/15-脂氧合酶抑制劑，保護RSL3誘導(dǎo)的急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的ferroptosis。在生理條件下黃芩素可能是一種很強的鐵螯合劑，調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)和抑制Fenton反應(yīng)[104]。黃芩作為清熱瀉火藥，在臨床上應(yīng)用廣泛，其中黃芩素是其發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，黃芩素能降低ROS、調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)、保護GPx4等，可以作為天然ferroptosis抑制劑使用。盡管迄今為止還沒有研究報道黃芩素通過抗ferroptosis而發(fā)揮對PD模型的治療作用，但基于目前發(fā)現(xiàn)PD模型中ferroptosis的普遍存在性，結(jié)合黃芩素在抗ferroptosis方面的比較確定的作用和機制，可以推測黃芩素在治療PD的藥物開發(fā)方面具有可觀的潛力。此外，臨床上已經(jīng)證明能改善心力衰竭的葛根素，也被最新的研究發(fā)現(xiàn)能夠減少erastin或異丙腎上腺素處理大鼠心肌細(xì)胞H9c2的ferroptosis，給予葛根素能夠緩解鐵負(fù)荷以及脂質(zhì)過氧化[105]。以往的研究表明葛根素可通過多種途徑緩解ROS的產(chǎn)生和細(xì)胞氧化損傷，如Hsp72[106]、JNK/p38 MAPK[107]、Ca2+內(nèi)流[108]等，可能具有多種靶點。

Ferroptosis作為新近的熱點，目前有關(guān)中藥及天然產(chǎn)物的相關(guān)文章很少，對于目前已有報道的單體在fer?roptosis的調(diào)節(jié)作用的機制（如圖1）還有待于進一步探討，以期在此基礎(chǔ)上繼續(xù)發(fā)掘具有潛在ferroptosis調(diào)節(jié)作用的中藥及活性成分。中藥及其活性成分具有調(diào)節(jié)靶點多、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、安全性高、廉價易得的許多優(yōu)勢，其中不乏在抗PD方面具有樂觀前景的單體。

谷氨酸（Glu）和ferroptosis誘導(dǎo)劑erastin可以抑制與谷氨酸反向轉(zhuǎn)運相關(guān)的xc-系統(tǒng)（System xc-）對胱氨酸（cystine）的攝取，從而導(dǎo)致谷胱甘肽（GSH）耗盡，并隨后抑制GSH依賴性的GSH過氧化物酶4（GPx4）。GPx4也可以直接被RSL3抑制。GPx4的抑制導(dǎo)致脂氧合酶（LOX）的激活，由此導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化氫（Lipid-OOH）可能積累在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中或非常接近內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這是產(chǎn)生活性氧（ROS）的起始步驟。黃芩素（Bai）則能上調(diào)GSH并降低二價鐵濃度；此外，黃芩素還能通過保護GPx4來抑制ferroptosis的發(fā)生。

圖1 Ferroptosis調(diào)節(jié)機制

5 結(jié)論

多巴胺能神經(jīng)元中氧化代謝活動頻率極高，但是其細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶體活力低，且富含能夠催化氧化還原反應(yīng)的鐵，因而對氧化應(yīng)激特別敏感。其內(nèi)豐富的多巴胺也能夠通過酶解代謝和非酶代謝產(chǎn)生毒性極大的活性氧。盡管PD與多巴胺能神經(jīng)元損傷的病理特征非常明顯，但是其機制仍尚不清楚。Ferroptosis作為一種新被發(fā)現(xiàn)不依賴caspase激活而依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵的細(xì)胞死亡機制，其在PD中的作用研究才剛剛開始。GSH的耗竭會誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定游離鐵離子的增加，而游離的鐵離子則能夠通過Fenton反應(yīng)增加細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。這些ferroptosis的特征在PD的病理進程中都有發(fā)現(xiàn)，其中包括中腦黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)游離鐵的含量升高、脂質(zhì)過氧化物生成、和ROS的堆積[109]。同時，應(yīng)用能夠抑制ferroptosis的藥物也體現(xiàn)出了在PD治療中的潛能，NAC和GSH合成酶的前體物，能夠有效的抑制PD模型小鼠中的神經(jīng)退行性病變，并在PD患者的早期臨床治療中恢復(fù)和改善運動能力[84]。鐵螯合劑也被證明了能夠改善動作PD模型動物的運動能力，并進入了II期臨床試驗[83]。最新的研究表明，ferroptosis特異性的抑制劑ferrostatin-1能夠有效的減少MPTP模型小鼠中多巴胺能神經(jīng)元的缺失[60]。以上的研究都顯示了ferroptosis可能作為一個重要的機制參與到PD病理進程中。與此同時，證據(jù)顯示ferropto?sis與三十年前在多種神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的oxytosis在信號調(diào)節(jié)等方面具有高度相似性，它們可能是同種非凋亡程序性細(xì)胞死亡的不同名稱。闡明ferroptosis/oxyto?sis死亡方式及其機制可能為抗PD藥物的研發(fā)提供重要的理論依據(jù)。