頤腦解郁復(fù)方對(duì)卒中后應(yīng)激大鼠腸道菌群的影響＊

劉海鵬，李小黎＊＊，田會(huì)玲，孫新月，林亮吟，陳弘婧，張淑靜

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

卒中后抑郁（Post-stroke Depression，PSD）是臨床腦卒中后常見并發(fā)癥。大樣本臨床研究顯示，PSD對(duì)腦卒中患者神經(jīng)功能康復(fù)、生活質(zhì)量和生存率有重要影響，明顯加重患者、家庭及社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前受到越來越多的重視[1]。本課題組以往的研究結(jié)果表明，頤腦解郁復(fù)方對(duì)PSD大鼠抑郁癥狀具有明顯改善作用[2]；另有研究表明，腸道菌群失調(diào)是神經(jīng)精神障礙疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素之一，腸道內(nèi)微生物群落的種類、組成和數(shù)量的平衡與焦慮、抑郁等疾病相關(guān)[3][4]。本研究擬從卒中后應(yīng)激大鼠腸道菌群的改變探討頤腦解郁復(fù)方對(duì)PSD的干預(yù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2012-0001，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫（20±2）℃、相對(duì)濕度50%-60%，光照明暗交替12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

頤腦解郁復(fù)方由北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院提供；對(duì)照藥物為鹽酸氟西汀膠囊，由禮來蘇州制藥有限公司提供，藥品批號(hào)為：國藥準(zhǔn)字J20170022。

1.3 主要試劑與儀器

Nanodrop（美國Thermo Scientific公司，型號(hào)NC2000），PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司，型號(hào)2720），酶標(biāo)儀（美國BioTek公司，型號(hào)FLX800T），電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)DYY-6C），凝膠成像系統(tǒng)（北京百晶生物技術(shù)有限公司，型號(hào)BG-gdsAUTO(130)），Agarose（美國 Invitrogen公司，貨號(hào) 75510-019），Q5? High-Fidelity DNA Polymerase（美國 NEB公司，貨號(hào) M0491L），Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（美國Invitrogen公司，貨號(hào)P7589），Marker（日本Takara公司，貨號(hào)DL15000或DL2000），TAE（美國Invitrogen公司，貨號(hào)AM9870），戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，貨號(hào)P3761-5），栓線（北京西濃科技有限公司，貨號(hào)2838-A4），曠場(chǎng)試驗(yàn)用敞箱（自制），強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)用水箱（自制）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥

健康SD雄性大鼠48只，清潔級(jí)，300±20g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。1周后根據(jù)體重隨機(jī)分組，分為假手術(shù)組、卒中后應(yīng)激組、西藥組和中藥組，每組各12只。假手術(shù)組只分離血管不插入線栓，卒中后應(yīng)激組、西藥組和中藥組均在大腦中動(dòng)脈阻塞術(shù)（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后7天進(jìn)行卒中后應(yīng)激模型制備。根據(jù)大鼠體重計(jì)算氟西汀膠囊、頤腦解郁復(fù)方藥液每日灌胃量，自應(yīng)激開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。中藥組每日灌胃1次，根據(jù)此前研究[2]確定灌胃劑量為9.92 g/（kg·d）；西藥組每日予氟西汀溶液每日等容積混懸液灌胃1次，按照成人用量7倍計(jì)算大鼠用量為2.33 mg/（kg·d）；余下各組均每日給于蒸餾水10 ml·kg-1灌胃1次。

2.2 模型制備

2.2.1 卒中模型的制備

采用MCAO所致的局灶性腦缺血模型。大鼠麻醉后，按照Bederson等的方法，將尼龍線栓從頸內(nèi)動(dòng)脈小口輕輕插入至Willie's環(huán)大腦前動(dòng)脈起始處；假手術(shù)組只游離血管不插線。結(jié)扎、縫合。2 h后將腦卒中模型大鼠尼龍線輕柔拔出1 cm左右，剪掉暴露于皮膚外的栓線。腦卒中模型大鼠入選的標(biāo)準(zhǔn)（按照ZeaLonga5級(jí)評(píng)分法取評(píng)分為1、2、3分的大鼠）：大鼠于缺血2h后出現(xiàn)腦缺血對(duì)側(cè)前肢倦曲或行走轉(zhuǎn)圈或行走向?qū)?cè)倒體征則納入，大鼠無此體征或于2 h后仍不清醒者棄去。

2.2.2 卒中后應(yīng)激大鼠模型的制備

制備局灶性腦缺血復(fù)合孤養(yǎng)、束縛應(yīng)激的卒中后應(yīng)激大鼠大鼠模型。缺血性腦卒中模型制備成功后，待術(shù)后7 d大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀稍恢復(fù)后，即將卒中后應(yīng)激大鼠組、西藥組和中藥組大鼠固定在特制的T型束縛臺(tái)上（自制），連續(xù)7 d，每天于10:00-16:00期間任取時(shí)間，予以2 h的行為限制，并予以單籠飼養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.3 行為學(xué)觀察

2.3.1 蔗糖水試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第14 d末，各組進(jìn)行蔗糖水試驗(yàn)。試驗(yàn)前，先給予20小時(shí)的禁食禁水，然后同時(shí)給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水：一瓶l%蔗糖水，一瓶普通飲用水。30分鐘后調(diào)換蔗糖水和純水的位置，60分鐘后取走兩瓶并稱量。計(jì)算大鼠糖水消耗比例（蔗糖水偏愛）=糖水消耗量/總液體消耗量。

2.3.2 曠場(chǎng)試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第14 d末，進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)。將大鼠置于場(chǎng)箱中心方格內(nèi)，觀察大鼠在3分鐘內(nèi)穿越格數(shù)（為水平運(yùn)動(dòng)得分，四爪均進(jìn)入方格時(shí)方可記數(shù)一次）、后肢直立次數(shù)（為垂直運(yùn)動(dòng)得分，兩前爪騰空或攀附墻壁時(shí)記數(shù)一次）。

2.3.3 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第14 d末，進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)。在大鼠禁食2l h后進(jìn)行。水深25 cm，水溫25±1℃，大鼠在水中不能以后爪支撐身體，也不能以前爪攀附于缸壁，連續(xù)觀察5 min，累計(jì)大鼠在水中游泳時(shí)間和停止掙扎、呈漂浮狀態(tài)的時(shí)間。每只大鼠僅進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)。

2.4 腸道菌群種類及豐度的差異研究

所有大鼠分別在實(shí)驗(yàn)第14 d末，行為學(xué)測(cè)試前，在超凈工作臺(tái)，通過揉腹等方法促使大鼠排便，每只大鼠至少取兩粒糞便，每粒糞便置于無菌凍存管中，保存于-80℃環(huán)境中。使用宏基因組DNA提取試劑盒提取糞便中的總DNA；以細(xì)菌16SrDNA基因的V3-V4可變區(qū)序列為靶標(biāo)，以帶有barcode序列的338F-806R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取PCR產(chǎn)物；PCR產(chǎn)物經(jīng)過定量及文庫構(gòu)建后，利用IlluminaMiSeqPE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，獲取細(xì)菌16SrDNA基因的V3-V4可變區(qū)堿基序列信息；利用QIIME軟件，對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行OTU（分類學(xué)操作單元）聚類，OUT代表序列與silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，獲取OUT對(duì)應(yīng)的分類單元（包括門綱目科屬種）及其相應(yīng)的豐度。聚類后的目標(biāo)序列按照97%的相似度計(jì)算數(shù)量，同時(shí)采用眾數(shù)原則對(duì)每一個(gè)操作分類單元進(jìn)行物種注釋，對(duì)各樣本（組）在不同分類水平的具體組成進(jìn)行分析（并檢驗(yàn)組間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。

表1 各組大鼠行為學(xué)變化結(jié)果（s，n=6）

表1 各組大鼠行為學(xué)變化結(jié)果（s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；與PSD組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

游泳掙扎時(shí)間/s（強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)）277.17±4.62 251.33±10.57▲▲257.17±20.49▲266.83±2.92*9.92 0.00組別假手術(shù)組卒中后應(yīng)激組西藥組中藥組F值P值蔗糖水偏好度（蔗糖水試驗(yàn)）0.80±0.04 0.66±0.05▲▲0.74±0.07 0.72±0.11 3.81 0.03曠場(chǎng)水平得分65.00±7.40 48.17±7.93▲▲61.83±15.42*61.67±5.12*10.63 0.02曠場(chǎng)垂直得分15.00±2.44 11.17±2.31▲▲13.17±1.47 13.33±1.96 3.40 0.04

圖1 菌群分類學(xué)組成和分布圖

3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊用Welch法分析，兩兩比較用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 蔗糖水試驗(yàn)結(jié)果

卒中后應(yīng)激組大鼠與假手術(shù)組相比較，其蔗糖水偏好度顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；西藥組與卒中后應(yīng)激組，中藥組與卒中后應(yīng)激組，中藥組與西藥組之間的對(duì)比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

4.2 曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果

卒中后應(yīng)激組大鼠與假手術(shù)組相比較，其水平得分和垂直得分均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01）；卒中后應(yīng)激組與西藥組和中藥組相比較，水平得分均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.05）；卒中后應(yīng)激組與西藥組和中藥組相比較，垂直得分降低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，P＞0.05）；中藥組與西藥組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

4.3 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)結(jié)果

卒中后應(yīng)激組與假手術(shù)組和中藥組相比較，游泳掙扎時(shí)間減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01，P＞0.05）；西藥組與假手術(shù)組相比較，游泳掙扎時(shí)間減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）；卒中后應(yīng)激組與西藥組相比較，游泳掙扎時(shí)間減少，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）（表1）。

4.4 菌群分類學(xué)組成的分布特征及菌群變化

在“屬”水平上，菌群分類學(xué)組成和分布的結(jié)果顯示，各組大鼠腸道菌群中具有明確分類的菌屬共68種，其中Lactobacillus、Bacteroides、Blautia等18種菌屬在數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占97.2%，其他50種劣勢(shì)菌屬因其含量過少，合記為Others（見圖）。①與假手術(shù)組相比，卒中后應(yīng)激組中Allobaculum、Sutterella、Dorea和rc4-4比例顯著下降（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）；Oscillospira比例顯著上升（P ＜0.01）。②與卒中后應(yīng)激組比較，中藥組大鼠糞便中Lactobacillus、Bacteroides、Parabacteroides、Roseburia、Dorea和 rc4-4比例顯著升高（均P＜0.01），Oscillospira比例顯著降低（P ＜0.05），其中以Lactobacillus和Bacteroides差距最為明顯，分別為27.91%vs5.96%和24.21%vs9.62%。③與西藥組相比，中藥組大鼠糞便中Bacteroides，rc4-4比例顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）（表2）。

表2 各組腸道菌群之間的比較檢驗(yàn)結(jié)果（s,n=6）

表2 各組腸道菌群之間的比較檢驗(yàn)結(jié)果（s,n=6）

注：與假手術(shù)組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與卒中后應(yīng)激組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與西藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

P值0.00 0.00 0.06 0.25 0.18 0.00 0.02 0.11 0.00 0.03 0.035 0.00 0.08 0.00 0.24 0.00 0.84 0.66組別菌屬Lactobacillus Bacteroides Blautia Enterococcus Prevotella Allobaculum Oscillospira[Prevotella]Sutterella Roseburia Coprococcus Dorea Ruminococcus Parabacteroides Clostridium rc4-4 Phascolarctobacterium[Ruminococcus]假手術(shù)組2.56±2.44 10.68±5.51 15.03±7.14 0.02±0.03 6.04±3.47 29.55±7.77 2.35±1.05 18.64±17.77 7.80±4.39 0.26±0.28 0.45±0.22 1.75±1.29 0.67±0.22 0.41±0.16 0.50±0.38 0.95±0.61 0.45±0.80 0.45±0.48卒中后應(yīng)激組5.56±3.41 9.62±2.88 12.21±12.39 35.75±39.70 8.75±8.87 1.45±1.33▲▲9.71±8.10▲▲4.42±4.26 0.40±0.31▲▲0.63±0.82 2.90±2.63▲0.22±0.06▲▲2.92±2.64 0.69±0.28 0.54±0.56 0.19±0.15▲1.07±1.37 1.07±1.37西藥組25.56±18.89▲▲**11.67±7.31 18.31±19.43 0.03±0.04 9.52±9.51 3.49±2.87▲▲5.03±1.54 2.95±2.06 4.15±1.68▲*5.49±5.67 1.66±1.61 1.30±0.66**1.60±1.55 0.96±0.38▲▲1.64±1.44 0.69±0.42 0.86±1.40 0.85±0.81中藥組27.91±14.40▲▲**24.21±5.23▲▲**##5.91±1.75 0.04±0.05 3.42±1.32 2.73±3.06▲▲3.42±1.86*8.01±5.41 1.30±1.07▲▲9.33±6.89▲▲**1.74±1.12 1.59±0.52**1.58±1.02 1.28±0.42▲▲**1.78±2.01 1.36±0.59**#1.04±1.54 1.04±0.89 F值9.92 9.37 8.78 10.33 9.17 9.89 10.39 9.78 8.92 8.91 8.66 8.46 2.58 7.93 10.03 6.30 0.29 0.54

5 討論

近期流行病學(xué)研究顯示，卒中后五年內(nèi)，PSD的綜合發(fā)生率為31%[5]。PSD的發(fā)生常伴有腸道功能障礙，出現(xiàn)體重減輕、腹瀉、食欲差等癥狀，嚴(yán)重影響腦卒中后的恢復(fù)、加重抑郁癥狀[6]。本研究行為學(xué)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，卒中后應(yīng)激組大鼠蔗糖水偏好度、曠場(chǎng)得分和游泳掙扎時(shí)間均顯著降低，表明卒中后應(yīng)激大鼠對(duì)美好事物的向往和陌生環(huán)境的好奇程度均明顯下降，而在危險(xiǎn)情況下的絕望程度增加，從而說明了卒中后應(yīng)激大鼠處于應(yīng)激狀態(tài)。與卒中后應(yīng)激組相比較，中藥組大鼠水平得分和游泳掙扎時(shí)間顯著升高，提示頤腦解郁復(fù)方在一定程度上改善了卒中后應(yīng)激大鼠的應(yīng)激癥狀。

PSD的發(fā)生與大腦關(guān)系密切，而腸腦軸（gut-brain axis）是胃腸道與大腦之間復(fù)雜的雙向調(diào)控通路，其整合了胃腸道和大腦間的營(yíng)養(yǎng)、內(nèi)分泌、神經(jīng)傳導(dǎo)和免疫學(xué)信號(hào)傳輸[7-9]，腸道菌群是這條通路的重要參與者，因此也有研究稱其為“微生物-腸-腦軸”[10-12]。腸道內(nèi)的自然菌群,如乳酸菌、擬桿菌、雙歧桿菌等，以相對(duì)恒定的比例長(zhǎng)期定植在固定區(qū)域，通過自身代謝改變周圍環(huán)境的成分,從而維持腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡。本研究結(jié)果顯示，與卒中后應(yīng)激組相比，中藥組大鼠糞便中Lactobacillus、Bacteroides、Parabacteroides、Roseburia、Dorea和rc4-4比例顯著升高，Oscillospira比例顯著降低，其中以乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）比例提升最為明顯；與西藥組相比，中藥組大鼠糞便中Bacteroides和rc4-4比例顯著升高。研究表明[13]，乳酸菌可通過調(diào)節(jié)腸道免疫、促進(jìn)神經(jīng)信號(hào)物質(zhì)產(chǎn)生、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌細(xì)胞激素等方面的作用來緩解和預(yù)防精神性疾病；腸道乳桿菌屬減少、腸球菌等需氧菌異常增加參與抑郁的發(fā)生過程[14]，而益生菌治療后，腸道菌群失調(diào)得到改善，患者的抑郁癥狀減輕[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，注射瑞士乳桿菌NS8可改善大鼠慢性束縛應(yīng)激引起的行為、認(rèn)知和生化異常，這種作用可能與微生物-腸-腦軸有關(guān)[16]。國外研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌對(duì)多糖的利用尤為突出，能幫助宿主高效的分解多糖，從而提高其營(yíng)養(yǎng)利用率[17]。擬桿菌還在維持腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡[18,19]，提高宿主免疫力[20]，促進(jìn)腸黏膜血管的生成和發(fā)育[21]等方面具有重要作用。由以上可知，乳桿菌屬和擬桿菌屬具有良好的益生作用，而乳桿菌屬和擬桿菌屬占據(jù)了中藥組大鼠腸道菌群（已知種類）52.12%的含量，從而說明，頤腦解郁復(fù)方可通過增加乳桿菌屬和擬桿菌屬的含量促進(jìn)腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡的恢復(fù)，進(jìn)而改善大鼠的類似抑郁癥狀。此外，與西藥組相比，中藥組大鼠糞便中擬桿菌屬（Bacteroides）含量明顯升高，提示頤腦解郁復(fù)方對(duì)于腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡的恢復(fù)可能優(yōu)于鹽酸氟西汀膠囊。目前關(guān)于Oscillospira、Parabacteroides、Roseburia、Dorea、和rc4-4的研究尚不深入，有待進(jìn)一步研究。

頤腦解郁方為本課題組前期治療PSD的中藥復(fù)方，含5味中藥（君藥-刺五加；臣藥-五味子、郁金；佐藥-梔子、川芎），具有益氣舒肝，調(diào)氣活血的作用。從中醫(yī)角度來講，PSD的中醫(yī)病機(jī)為脾腎虧虛，氣滯痰瘀，病位在腎、肝、脾三臟，而“腎司二便，肝主疏泄，肝與大腸相別同，脾主升清降濁”，腎、肝、脾三臟均可從不同角度調(diào)節(jié)腸道功能，因此頤腦解郁復(fù)方可以通過調(diào)節(jié)腎、肝、脾的功能間接起到調(diào)節(jié)腸道功能的作用，從而改善腸道菌群。從單味藥現(xiàn)代研究來看，刺五加、五味子和梔子已經(jīng)被證實(shí)具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群的作用。研究發(fā)現(xiàn)，刺五加能有效升高犢牛消化道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量,促進(jìn)犢牛腸道內(nèi)有益菌菌群的生長(zhǎng)和增殖[22]；刺五加提取物有助于升高斷奶仔豬腸道內(nèi)容物乳酸桿菌的數(shù)量,抑制大腸桿菌增殖,顯著增加腸道微生物的多樣性[23]；五味子能有效地調(diào)整肝硬化大鼠的腸道菌群，并降低其肝損傷，是一種理想的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑[24]；梔子中、高劑量對(duì)大鼠腸道內(nèi)腸桿菌具有一定的抑制作用，但不影響雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，提示梔子沒有導(dǎo)致大鼠腸道菌群失調(diào)，而是起到了改善其腸道菌群的作用[25]。雖然沒有研究證實(shí)郁金和川芎具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，但郁金和川芎都具有調(diào)節(jié)肝膽的作用，猜測(cè)其可能具有通過調(diào)節(jié)膽汁分泌間接影響腸道菌群的作用。綜上所述，可以推測(cè)頤腦解郁復(fù)方通過增加了卒中后應(yīng)激大鼠腸道中乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）的數(shù)量，從而減輕了其抑郁癥狀，其相關(guān)機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。