越鞠丸對小鼠海馬組織中NO-cGMP信號通路的影響＊

王 薇，賈 蓉，沈琴琴，薛文達＊＊

（1.南京中醫藥大學基礎醫學院轉化系統生物學和神經科學研究中心/中醫腦病重點實驗室 南京210023；2.南京中醫藥大學心理學院 南京 210023；3.南京中醫藥大學第一臨床醫學院 南京210023；4.南通大學神經再生協同創新中心 南通 226001）

抑郁癥是一種復雜的情感障礙，常伴有自殺傾向而導致高死亡率和致殘率[1]，不利于個人的健康和社會的穩定。其發病機制復雜多元，具體的病因現在仍然不是十分清楚。臨床和動物實驗數據都證明谷氨酸參與了抑郁樣行為，阻斷NMDA受體能夠產生抗抑郁作用[2]。此外，藥物阻斷NMDA受體如氯胺酮能夠產生很好的抗抑郁作用[3]。與之相類似，高劑量的選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑（Selective Serotonin Reuptake Inhibitor，SSRI）抗抑郁類藥物也能夠對NMDA受體活性產生影響[4]。研究還發現抑郁癥自殺者死后的腦組織中存在N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體系統異常現象[5]。目前臨床上用于治療抑郁癥的藥物大多起效緩慢、作用有限并且長期服用有毒副作用。近年來，氯胺酮的快速持久抗抑郁作用及其相關機制研究已成為抗抑郁藥物研究的熱點[6,7]。但是氯胺酮的成癮性、神經毒性等副作用限制了其臨床應用。中醫藥治療抑郁癥經驗豐富，方藥眾多，副作用小。其中，越鞠丸出自《丹溪心法》，是治療郁證的經典方。由于抑郁癥與郁證具有相似性，因而越鞠丸也被廣泛應用于現代抑郁癥的治療[8]。前期研究發現，越鞠丸具有與氯胺酮相似的快速起效的抗抑郁作用[9,10]。我們在小鼠模型上的實驗結果顯示越鞠丸和氯胺酮的快速抗抑郁作用需要NMDA信號的參與[11]，如NMDA受體NR1的表達下降[12]。然而越鞠丸的抗抑郁作用是如何通過NMDA信號通路的仍然不清楚。

研究表明NO-cGMP信號通路參與了抗抑郁藥物的作用，NMDA受體的激活能夠降低NO合成酶（nitric oxide synthase，NOS）的活性，從而降低從L-精氨酸轉變為NO的合成[13,14]，并引起細胞中cGMP含量升高[15]。給予氯胺酮可降低小鼠海馬組織中cGMP含量，提示NO-cGMP信號通路參與了氯胺酮的抗抑郁機制[16]。NO作為神經系統中重要神經遞質分子在抑郁癥研究中越來越受到重視，有研究顯示大鼠海馬腦區NO水平的降低可產生抗抑郁效應[17]。NO能夠靶定多個基因，如可溶性鳥苷酸環化酶（soluble guanylate cyclase，sGC），能夠轉化鳥苷-5′-三磷酸（guanosine 5-triphosphate，GTP）為環鳥苷酸（cyclic guanosine 3,5-monophosphate，cGMP）[18]，從而調控下游信號通路，參與抗抑郁藥物的作用。NO作為神經遞質參與中樞神經系統的遞質如血清素的釋放[19]，包括痛覺，突觸可塑性等，參與了抑郁癥的發生過程。抑制NOS的活性能夠增強SSRI類藥物的抗抑郁作用[20]。近年研究也發現，降低NO水平與抗抑郁作用密切有關，從而支持了NO是參與了抑郁癥的重要分子[21]。NO是cGMP的有效調節者，而cGMP參與了抑郁癥的發生[22]。因此，NO-cGMP信號通路是參與調控抑郁樣表型的重要通路[23]。因此越鞠丸是如何通過影響NMDA受體，從而調控NO-cGMP信號通路是亟需要探索的問題。

本研究擬采用ELISA法檢測單次給予越鞠丸后小鼠海馬組織中NO和cGMP含量的動態變化，并通過行為學測試來分析NO合成底物L-精氨酸（L-arg）對越鞠丸抗抑郁作用的影響，以探討越鞠丸對NO-cGMP信號通路的作用影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明小鼠，雄性，7-8周齡，體重為20-25 g，購自南京市青龍山動物繁殖場（動物合格證號：SCXK(蘇)2014-0002）。實驗前小鼠適應飼養環境1周，屏障間環境溫度22-24℃，濕度40%-60%，晝夜交替時間12 h，動物可自由攝食飲水。

1.2 實驗藥物

實驗用所用中藥材購自南京中醫藥大學國醫堂門診部藥房。越鞠丸由蒼術100 g、神曲100 g、香附100g、梔子100 g、川芎100 g組成，將藥材打粉后過篩混勻。將藥粉浸泡于95%乙醇（6倍體積）中，靜置48 h后收集上清液，重復2次，收集3次獲取的上清液，過濾，于55℃減壓濃縮，獲得醇提越鞠丸。藥物制備好后于-20℃保存備用。臨用前用生理鹽水配制成所需濃度。

1.3 實驗試劑

本 實驗 所用 NO（JEB-12547）和 cGMP（JEB-12702）ELISA試劑盒購自南京金益柏生物科技公司。L-arg購自阿拉丁試劑公司（貨號：N109208），臨用前用生理鹽水配制成濃度為750 mg·kg-1的藥液[24]。

1.4 ELISA法測定NO和cGMP的含量

小鼠分為兩組：空白對照組和越鞠丸給藥組。給藥組動物按越鞠丸濃度13.5 g·kg-1的劑量進行灌胃給藥[8]，分別于給藥12 min，24 min，30 min，3 h，24 h后，取小鼠海馬組織，液氮速凍后，于-80℃冰箱凍存備用。然后按試劑盒說明書進行操作，分別測定各組中NO和cGMP濃度。

1.5 行為學測試分析L-arg對越鞠丸抗抑郁作用的影響

實驗小鼠分為4組：空白對照組、L-arg給藥組、越鞠丸給藥組、L-arg+越鞠丸給藥組。其中，空白對照組：小鼠腹腔注射生理鹽水；L-arg給藥組：小鼠腹腔注射L-arg 30 min后注射生理鹽水；越鞠丸給藥組：小鼠腹腔注射生理鹽水30 min后灌胃給予越鞠丸；L-arg+越鞠丸給藥組：小鼠腹腔注射L-arg 30 min后灌胃給予越鞠丸。以上4組實驗動物最后1次給藥30 min后進行行為學測試。

由于本實驗采用急性給藥方式，因而采用懸尾測試方法來分析L-arg對越鞠丸抗抑郁樣行為的影響。測試前將小鼠提前放入測試房間30 min以適應環境。懸尾測試如下：將小鼠尾部粘貼在鉤子上，倒掛在測試箱中，測試時間為6 min，記錄后4 min內小鼠的累計不動時間。采用ANY-maze軟件進行小鼠的軌跡分析。

開場測試（Open Field Test，OFT）：將小鼠放入方箱（40 cm*40 cm）內的底面中心，進行5 min的觀察和攝像。記錄在5 min內小鼠的總活動路程和在中央區域的活動時間。采用ANY-maze軟件進行小鼠的行為分析。

1.6 統計分析

所有數據均采用SPSS 19.0統計軟件進行處理，數據均采用s表示。各組間兩兩比較采用t檢驗，兩種藥物處理數據間比較采用兩因素方差分析（Two-Way ANOVA），事后檢驗（post hoc）采用 Bonferroni，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 越鞠丸對小鼠海馬組織中NO含量的影響

單次給予越鞠丸灌胃后，檢測12 min，24 min，30 min，3 h，24 h這幾個不同時間點的小鼠海馬組織中NO的含量變化。檢測結果顯示給予越鞠丸12 min后，小鼠海馬組織中的NO含量顯著下降（P＜0.05），給藥后24 min出現顯著上升（P ＜0.05），之后的30 min、3 h、24 h后NO含量與對照組相比都沒有明顯差異（圖1）。

2.2 越鞠丸對小鼠海馬組織中cGMP含量的影響

由于NO可以調節胞內cGMP含量，因此我們在單次給予越鞠丸灌胃后，檢測 12 min、24 min、30 min、3 h、24 h這幾個不同時間點的小鼠海馬組織中cGMP的含量變化。結果顯示單次給予越鞠丸12 min后，小鼠海馬組織中的cGMP含量與NO含量變化趨勢一致，也出現了顯著下降（P＜0.05），給藥后24 min出現顯著上升（P＜0.05），之后的3個時間點cGMP含量給藥組與對照組相比沒有顯著差異（圖2）。

2.3 L-arg對越鞠丸抗抑郁樣行為的影響

上述結果顯示越鞠丸能夠快速調節胞內NO含量，為了進一步確認NO信號通路參與越鞠丸抗抑郁作用。我們采用NO合成的前提L-arg預先給藥處理，檢測是否能夠阻斷越鞠丸的抗抑郁作用。懸尾測試結果顯示，與對照組相比，單次給予越鞠丸，能夠顯著減少小鼠的不動時間（P＜0.01），與越鞠丸組相比，預先給予L-arg則能夠顯著增加小鼠的不動時間（P＜0.01），另外，與對照組相比，單獨給予L-arg后小鼠不動時間無明顯變化（圖3A），提示單獨給予L-arg不能產生抗抑郁作用。

圖1 單次給予越鞠丸后不同時間點的小鼠海馬組織中NO的含量變化

圖2 單次給予越鞠丸后不同時間點的小鼠海馬組織中cGMP的含量

為了檢測越鞠丸或者L-arg對小鼠自發活動是否具有影響，我們檢測了單獨給藥和聯合用藥后的開場行為。在開場測試中發現，無論是單獨給予越鞠丸或L-arg，還是聯合給藥都不能夠改變小鼠的自發活動性，顯示藥物具有真實的抗抑郁作用（圖3B）。

3 討論

圖3 預處理L-arg對于越鞠丸抗抑郁作用的影響

本研究基于越鞠丸快速抗抑郁是與NMDA受體通路有關，探索越鞠丸調節胞內NMDA受體下游的NO和cGMP小分子變化，通過不同時間點的檢測發現越鞠丸快速降低了小鼠海馬組織的NO和cGMP含量，從而引起下游分子信號的變化，產生快速抗抑郁作用。進一步通過預先給予NO合成前體L-arg，結果發現能夠阻斷越鞠丸的抗抑郁作用，并且對于小鼠的自發活動沒有影響，證實了越鞠丸的抗抑郁作用依賴于NO-cGMP信號通路。

近年來，快速抗抑郁的藥物逐漸成為抑郁癥治療的研究熱點，其中，氯胺酮是這類抗抑郁藥物的典型代表。氯胺酮是一種NMDA受體拮抗劑，單次劑量的氯胺酮便能迅速改善抑郁癥病人的抑郁癥狀[25]和抑郁小鼠的抑郁表型。唐娟娟等研究表明，與氯胺酮相比，越鞠丸可降低前額葉中NR1表達增強，且持續時間更長。夏寶妹等研究顯示，越鞠丸可持久降低獲得性無助模型動物的海馬組織中NR1表達水平的升高。這些研究也提示NMDA受體（尤其是NR1）作為越鞠丸快速持久抗抑郁的靶向分子。NMDA受體可從上游調控NO-cGMP信號通路，即突觸前膜釋放的谷氨酸作用于NMDA受體，鈣離子內流后結合鈣調蛋白，激活NO合成酶，催化L-arg合成NO，進而NO激活鳥苷酸環化酶，增加cGMP的合成。NO作為一種重要的新型神經遞質分子，參與多種生理生化過程，其與血管通透性、神經元興奮性、神經突觸可塑性有密切關系[26]。如果NMDA受體被過度激活，則會生成過量的NO，從而增加對神經元的毒性作用。張洪燕等研究發現血漿NO濃度與抑郁癥狀顯著相關[27]。Joca等研究顯示大鼠海馬組織中NO濃度的降低可產生抗抑郁作用。而Yazir等研究也顯示抑制NO合成酶和鳥苷酸環化酶可抑制慢性抑郁的形成[28]。本研究中首次揭示單次給予越鞠丸后12 min時，越鞠丸給藥組與空白對照組相比，顯著下調了NO濃度，隨后在24 min時出現了恢復性的增加，之后趨于平穩，提示越鞠丸通過快速下調NO濃度產生抗抑郁作用，系統揭示了越鞠丸調控海馬組織中NO濃度的動態變化過程?？瞻讓φ战M在不同時間點也出現了NO含量的增加和恢復，這可能與受到了給藥這一過程的刺激因素有關，朱東亞等研究顯示應激能夠引起胞內NO含量的增加[29]，這與本研究的結果也是相一致的。

以往研究認為NO-cGMP信號通路參與了抑郁癥的發病機制[30]。cGMP可被G蛋白偶聯受體激活的蛋白激酶活化，繼而將信息從胞外傳遞至細胞核。cGMP可改善血管重塑，并在神經信號傳遞、細胞凋亡等方面具有重要作用[31]。果木素（frutalin）的抗抑郁作用依賴于NO-cGMP信號通路[32]。抑郁癥病人研究中也發現NO含量的增加，與之變化相一致的cGMP含量也顯著增加了[33]。本研究發現，cGMP的濃度變化在越鞠丸處理后與NO的濃度變化是一致的，都在12 min時表達下降，在24 min時恢復性增加，隨后恢復正常水平，提示兩者的濃度變化可能都是越鞠丸的作用所引起的，而這一濃度水平的快速調整是越鞠丸引起快速抗抑郁作用的重要機制之一。

進一步，為了確證NO在越鞠丸抗抑郁中的關鍵作用，本研究通過在越鞠丸給藥前預先給予NO合成的關鍵前體L-arg，L-arg由eNOS（血管內皮一氧化氮合酶）催化合成NO，NO從內皮細胞釋放，用以響應刺激和旁分泌過程[34-35]。L-arg能夠在小鼠強迫游泳測試中逆轉鋰鹽和胍丁胺的抗抑郁作用，提示兩者的作用依賴于NO信號通路[36]。此外，經典抗抑郁藥物丙咪嗪[37]、文拉法辛[38]和鋰鹽[39]的抗抑郁作用都能夠被L-arg所阻斷。在本研究結果中也發現L-arg能夠阻斷越鞠丸的抗抑郁作用，說明越鞠丸的抗抑郁作用是依賴于NO-cGMP信號通路來發揮作用的。同時為了檢測藥物本身對小鼠自發活動的影響，在開場測試中也檢測發現無論是L-arg還是越鞠丸或是二者聯合用藥都不能夠對小鼠的自發活動產生作用，從另一個方面確立了越鞠丸抗抑郁作用及被L-arg阻斷的真實性。

本研究通過系統檢測越鞠丸處理后不同時間點小鼠海馬組織中NO和cGMP濃度的變化，并利用NO合成前體L-arg預處理阻斷越鞠丸的抗抑郁作用，探討越鞠丸對小鼠海馬腦區NO-cGMP信號通路的影響。下一步應繼續研究cGMP調控的下游信號分子，如sGC、nNOS、eNOS等的變化，進一步深入分析越鞠丸發揮快速持久抗抑郁作用的分子機制，為其臨床應用提供理論依據。