參芪益智顆粒對APP/PS1轉基因小鼠血清MMP2和VEGF含量的影響＊

秦莉霞，魏江平，文 雯，潘 婷，徐世軍＊＊

（1.成都中醫藥大學藥學院 成都 611137；2.成都中醫藥大學中醫腦病藥物整合轉化研究所 成都 611137）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer Disease，AD）是一種臨床上以學習記憶障礙，認知功能障礙，人格和行為改變為特征的中樞神經系統退行性疾病[1]，是老年癡呆的主要病癥[2]。血腦屏障（blood brain barrier，BBB）是維持中樞神經系統穩態核心屏障[3]。今年的權威評論文章指出BBB破壞在AD及其他退行性疾病形成過程中扮演重要角色并是今后研究神經相關疾病的重要方向[4]。神經影像學研究指出MCI和早期AD患者海馬、部分白質和灰質部位均可見BBB損傷[5-7]。高級動態增強磁共振成像（MRI）檢測也發現中樞神經系統腦微出血增加可以反映腦微血管完整性的破壞[7-10]。然而BBB破壞與外周相關損傷因子密切相關，因此調節外周損傷因子對AD干預有一定的治療作用。

血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是一種神經細胞衍生的生長因子。它在中樞神經系統（central nervous system，CNS）中分布廣泛[11]，不僅能夠維持血管生成和血管滲透作用，還具有一定的神經元保護作用[12]。MMP2屬于基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）家族。MMPs是細胞外基質金屬蛋白酶體的重要組成部分，它們既可以影響CNS細胞外基質的重塑和降解，又可以參與調節BBB的通透性[13]。參芪益智顆粒是根據王永炎教授長期臨床經驗提煉的經驗方，具有益氣健脾、活血化瘀、安神益智、解毒通絡之效。課題組前期研究發現參芪益智顆粒對5XFAD小鼠腦內老年斑的數量、膠質細胞過度激活和腦內Aβ1-42的含量均有一定的調節作用[14]，但對于外周血中相關影響因子尚未進行研究。故本研究以APP/PS1雙轉基因小鼠為研究載體，考察參芪益智顆粒對該模型小鼠學習記憶能力、病理形態學和血清內VEGF和MMP2含量變化，為參芪益智顆粒治療AD提供依據。

表1 參芪益智顆粒對APP/PS1癡呆小鼠避暗實驗的影響

1 材料

1.1 藥物與試劑

參芪益智顆粒（SYG）由北京師范大學提供，批號：20151215；鹽酸多萘哌齊片，衛材中國藥業有限公司制造，批號：1607020；蘇木精，美國Thermo Fisher，批號：20170308；伊紅，美國Thermo Fisher，批號：20170308；小鼠VEGF和MMP2 ELISA試劑盒均為依科賽生物科技（太倉）有限公司產品，批號分別為：EM009-96、21G359。

1.2 動物

45只SPF級APP/PS1雙轉基因小鼠，3月齡，雌性，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2014-0004。

1.3 儀器

Morris水迷宮分析系統（荷蘭，Noldus）；PAT-8避暗實驗視頻分析系統（成都泰盟）；OFT-100大小鼠開場活動實驗系統（成都泰盟）；TDZ5-WS離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；KD-98-IIA恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；3001酶標儀（Thermo electron corporation）；DM1000徠卡顯微成像系統（德國，Leica）；UC7超薄切片機（德國，Leica）。

2 方法

2.1 分組及給藥

將45只APP/PS1小鼠按體重隨機分為5組，即模型組，安理申組（1.5 mg/kg），參芪益智顆粒高（12.6 g/kg），中（6.3 g/kg），低（3.15 g/kg）3個劑量組，另取10只同月齡C57BL/6小鼠作為對照，給藥體積10 ml/kg，1次/d，連續灌胃給藥180d，模型組和對照組給予等體積蒸餾水。

2.2 行為學評價

避暗實驗記錄各小鼠第二天檢測的逃避潛伏期和錯誤次數為評價指。Morris水迷宮中記錄隱藏平臺實驗連續訓練5天的逃避潛伏期為評價指標；記錄空間探索實驗小鼠穿越平臺次數和平臺象限所占時間百分比為評價指標。開場試驗記錄各小鼠站立次數，運動時間及靜止時間為評價指標。

2.3 HE染色

行為學試驗結束24 h后，眼球取血，3500 r/min離心10 min分離血清，-20℃保存備用；脫頸椎處死小鼠，冰浴取腦，分離左側海馬，用4%多聚甲醛固定，常規HE染色法操作，觀察海馬CAI區組織病理學變化。

2.4 MMP2和VEGF含量檢測

取凍存血清及試劑盒相關試劑恢復至室溫，嚴格根據對應試劑盒說明書操作，分別測定血清MMP2和VEGF含量。

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 SYG對APP/PS1雙轉基因小鼠避暗實驗的影響

由表1可知，與空白組比較，模型組逃避潛伏期縮短，錯誤次數增多（P＜0.05），與模型組比較，SYG組的逃避潛伏期延長，錯誤次數降低。

3.2 SYG對APP/PS1雙轉基因小鼠Morris水迷宮學習記憶能力的影響

由圖1可知，與空白對照組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05）；進入平臺象限次數和進入平臺象限百分比顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，SYG給藥組逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05）；進入平臺象限次數和進入平臺象限百分比顯著增多（P＜0.05）。

3.3 SYG對APP/PS1雙轉基因小鼠開場運動能力的影響

由表2可知，與空白對照組比較，模型組小鼠運動時間，運動總路程，站立次數均顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，SYG中、低劑量組給藥組靜止時間，運動時間，運動總路程均顯著增加（P＜0.05），SYG高劑量組站立次數顯著增多（P＜0.05）。

圖1 SYG對APP/PS1小鼠Morris水迷宮的影響

表2 SYG對APP/PS1小鼠開場實驗的影響（s）

表2 SYG對APP/PS1小鼠開場實驗的影響（s）

注：與空白組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

站立次數/次20.83±2.32*9.50±6.44#11.83±4.07 21.00±2.67*8.83±4.22 11.83±7.08組別空白組模型組安理申組SYG高劑量組SYG中劑量組SYG低劑量組給藥劑量/（g·kg-1）— —1.5 12.6 6.3 3.15靜止時間/s 110.44±3.58 119.70±18.71 128.23±14.75 125.62±9.58 151.21±8.53*149.29±15.14*運動時間/s 197.41±7.22*180.37±18.71#171.84±14.75 174.45±9.58 145.22±9.27*150.78±15.14*總路程/cm 2070.73±188.45*1762.65±259.51#1675.78±334.09 1769.78±232.86 1395.61±224.59*1233.54±253.69*

3.4 SYG對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬組織病理學的影響

由圖2可知，與空白對照組比較，模型組海馬神經細胞數量明顯減少，排列稀疏，可見細胞固縮及空泡化；與模型組比較，SYG各給藥組神經細胞數量減少，排列稀疏，細胞固縮及空泡化現象明顯緩解。

3.5 SYG對APP/PS1雙轉基因小鼠血清MMP2和VEGF含量的影響

由圖3可知，與空白對照組比較，模型組血清MMP2和VEGF含量均顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，SYG各給藥組血清MMP2和VEGF含量均顯著降低（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01，P ＜ 0.001）。

4 討論

距1906年德國醫生阿洛伊斯·阿爾茨海默（Alois Alzheimer）公布AD以來已有100多年歷史，然而對其產生機制仍不清楚。值得注意的是AD并非現代人專利，2000多年前我國已經有類似的記載，歷代累積了大量文獻資料及應對方藥。AD屬于中醫“喜誤”、“喜忘”、“呆病”、“恍惚”、“失志”等范疇，其本質是本虛標實證，由外部環境（如風、寒、濕、疫等）和和內部因素（痰、瘀）共同作用致病。“毒損腦絡”是王永炎院士提出的癡呆病變機制，而解毒通絡則是治療癡呆的關鍵手法。參芪益智顆粒是基于此理論上的經驗方，方中黃芪、黃芩、人參有效活性成分黃芪皂苷[15]、黃芪多糖[16]、人參多糖[17-18]、黃芩苷[19]等可通過多種機制改善AD動物模型病理進程。前期實驗也證實參芪益智顆?？筛纳艫D動物模型學習記憶能力，本次研究也觀察到相同的實驗結論。參芪益智顆粒不僅能夠改善APP/PS1小鼠學習記憶障礙，還可以調節其精神行為異常。

BBB是控制中樞神經系統穩態的唯一屏障，而包括AD在內的多種神經系統疾病的研究中顯示BBB功能出現障礙[20-23]。AD患者影像學研究和尸檢報告均顯示存在BBB損傷[5-10,24]，同時一些動物模型如APP/PS1小鼠[25]和5xFAD小鼠[26]均存在BBB破壞。BBB破壞與心血管性疾病如動脈粥樣硬化和高血壓等密切相關，并與一些血管因子和酶異常有關。VEGF與血管生成、神經元活性、軸突可塑性、血管通透性密切相關[27]，且參與調節中樞系統疾病BBB的滲透和病理進程[28-29]，MMPs參與神經血管生成的同時，在如中風等神經系統疾病中表達增加[30-31]，其家族成員MMP2和MMP9參與調節BBB相關蛋白降解的同時參與調節BBB通透性[32-34]。因此改善外周VEGF和MMP2含量對BBB有保護作用。本研究結果顯示參芪益智顆?？山档虯D模型動物血清中MMP2和VEGF的含量。綜上可知參芪益智顆粒改善APP/PS1小鼠學習記憶功能可能與以下兩方面有關：直接改善腦內AD病理變化；調節外周BBB破壞的潛在影響因子，阻止AD病變。

圖2 SYG對APP/PS1小鼠海馬CA1區病理狀況的影響

圖3 SYG對APP/PS1小鼠血清MMP2和VEGF含量的影響