不同電針對(duì)快速老齡化癡呆小鼠行為學(xué)和海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響＊

邵淑君，唐銀杉，曹 瑾，許安萍，田朝陽(yáng)，郭 郁，向杜煉，李志剛，鄔繼紅＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院中醫(yī)康復(fù)科 杭州 310000）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）又稱(chēng)老年性癡呆，是一種起病隱匿的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是造成老年人癡呆的最常見(jiàn)原因，約占60%-80%。AD的主要臨床表現(xiàn)為情景記憶障礙[1]、代謝失調(diào)[2]及晚期心理和身體活動(dòng)的減少，給家庭和社會(huì)造成了極大的負(fù)擔(dān)和壓力。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年全球癡呆患者約為3 560萬(wàn)，預(yù)計(jì)人數(shù)每20年翻一番，2030年為6 570萬(wàn)，2050年為11 540萬(wàn)[3]。目前，用于治療AD的藥物和方法十分有限且療效欠佳，而針刺治療具有整體調(diào)節(jié)、療效好，起效快的特點(diǎn)，其療效已被大量臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[4-6]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞在AD等以認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中發(fā)揮著重要的作用[7-8]。AD早期星形膠質(zhì)細(xì)胞被廣泛激活[9]，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可誘發(fā)多種炎癥因子釋放，加劇β淀粉樣蛋白（beta amyloid protein,Aβ）沉積并誘導(dǎo)神經(jīng)元功能障礙[10]，從而改善認(rèn)知功能。因此星形膠質(zhì)細(xì)胞是調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥的重要靶點(diǎn)。基于此，本實(shí)驗(yàn)擬從電針調(diào)節(jié)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)來(lái)探討針刺干預(yù)治療AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康的清潔級(jí)快速老化小鼠亞系（Senescence accelerated mouse/prone8,SAMP8）小鼠，雄性，8月齡，體重30±2 g，共30只。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為模型組、音樂(lè)電針組和脈沖電針組，每組10只。同背景、同月齡正常老化小鼠亞系（Senescence accelerated mouse/resistance,SAMR1）小鼠10只作為空白組。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由天津中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（津）2008-0001。于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)單籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性的喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 主要試劑

免疫組化S-P超敏試劑盒（抗兔）、DAB顯色試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；兔抗單克隆GFAP抗體：美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

Morris水迷宮：上海移碼數(shù)字有限公司；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜穩(wěn)流電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；4℃低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；LH-202型韓氏電針儀：南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司；ZJ-12H型音樂(lè)電針治療儀：深圳市圣祥高科技有限公司；華佗牌無(wú)菌針灸針:0.25 mm*13 mm，蘇州醫(yī)療用品公司廠。

1.4 干預(yù)措施

脈沖電針組：選取“百會(huì)”、“印堂”、“人中”（參照我國(guó)針灸研究會(huì)制定的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜”），用自制鼠套進(jìn)行束縛，用華佗牌無(wú)菌針灸針（0.25 mm*13 mm）1寸毫針進(jìn)行針刺，“人中”快速點(diǎn)刺后，“百會(huì)”、“印堂”皆向下平刺進(jìn)針，進(jìn)針深度為3-4 mm，針柄連接HANS-LH202型電針，電針輸出頻率為1 Hz，電壓為2 V，電流強(qiáng)度為0.6 mA，針刺強(qiáng)度以針體微顫，小鼠頭部微晃動(dòng)為最佳，每次干預(yù)20 min，每天1次，共15天。

音樂(lè)電針組：針刺時(shí)用相同規(guī)格的鼠套進(jìn)行束縛，選穴及針刺方法同脈沖電針組。“百會(huì)”、“印堂”連接音樂(lè)電針治療儀，選取節(jié)奏明朗，速度與力度適中的的音樂(lè)處方《碧海楊帆》，強(qiáng)度以小鼠保持安靜，不掙扎嘶叫為佳，20 min/天，每天1次，共15天。

正常對(duì)照組：在其他治療組治療的同時(shí)，抓取一次，并用相同規(guī)格的鼠套進(jìn)行干預(yù)，20 min/天，每天1次，共15天。

模型組：同正常對(duì)照組。

1.5 Morris水迷宮

治療結(jié)束后，采用Morris水迷宮測(cè)試小鼠定位航行及空間探索能力。Morris水迷宮系統(tǒng)由水迷宮裝置（直徑100 cm，高50 cm的圓形水池）、平臺(tái)和圖像自動(dòng)采集、處理系統(tǒng)（包括攝像機(jī)，電腦顯示器和分析軟件）組成。隨意將水池分為4個(gè)象限（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限），圓柱形平臺(tái)直徑5 cm，高28 cm，放置于第Ⅲ象限中央。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，先在水池中注入溫水（溫度保持在21±2℃），水面高出平臺(tái)表面1cm左右，再用墨汁將水水染成黑色，Morris水迷宮設(shè)置完成。①定位航行實(shí)驗(yàn)：測(cè)試時(shí)，先將動(dòng)物置于平臺(tái)上訓(xùn)練10 s，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限各選距離水池圓心相等的點(diǎn)作為入水點(diǎn)，然后將小鼠頭朝池壁輕輕放入水中，記錄小鼠從入水之后到上臺(tái)的時(shí)間(即逃避潛伏期，escape latency)。小鼠登上平臺(tái)5 s后終止記錄，最長(zhǎng)記錄時(shí)間為60 s，若小鼠在60 s內(nèi)仍不能登上平臺(tái)，則引導(dǎo)其上臺(tái)。各象限每天訓(xùn)練1次，共5天，做統(tǒng)計(jì)分析；②空間探索實(shí)驗(yàn)：將小鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限依次放入水中，每象限各訓(xùn)練一次，共5天，記錄60 s內(nèi)小鼠游泳總距離，做統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 腦組織取材及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 免疫組化方法

Morris水迷宮結(jié)束后第二天取材，每組小鼠隨機(jī)選取5只，10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉（0.35 ml/100 g），3分鐘后，打開(kāi)胸腔，暴露小鼠心臟，將灌注針頭經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，快速滴注100毫升的生理鹽水，至小鼠肝臟完全變白以及右心耳流出澄清的液體后，再快速灌注4%多聚甲醛，觀察小鼠的肢體和尾巴僵硬后，立刻斷頭取出全腦，迅速將腦放入固定液（4%多聚甲醛）中。24 h后將固定后的腦組織進(jìn)行酒精上行脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，做連續(xù)冠狀切片，片厚6 μm，選取海馬結(jié)構(gòu)完整且呈水平位的切片進(jìn)行GFAP免疫組化ABC法檢測(cè)。免疫組化染色的具體步驟：常規(guī)二甲苯脫蠟；下行梯度酒精水化；PBS洗3×3 min；0.01 mol·L-1的枸櫞酸緩沖液熱（溫度90-95℃）修復(fù)抗原10 min；PBS洗3×3 min；滴加雙氧水，10 min；PBS洗3×3 min；正常山羊血清室溫下封閉10 min；滴加一抗GFAP抗體（均以1∶500稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜；PBS洗3×5 min；滴加生物素化二抗，10 min；PBS洗3×3 min；滴加生物素化三抗，10 min；PBS洗3×3 min；DAB顯色液顯色，自來(lái)水洗3×5 min；蘇木素復(fù)染，自來(lái)水洗3×5 min；常規(guī)上行酒精脫水；二甲苯透明2×10 min；封片。以0.1 mol·L-1PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組。采用Image-Pro Plus Analysis Software采集圖像和分析。

表1 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的比較(s，s)

表1 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的比較(s，s)

注：與空白組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

n第4天44.99±7.25第5天39.16±5.92 53.46±7.67 40.19±6.39##43.03±6.73#組別空白組模型組音樂(lè)電針組脈沖電針組10 10 10 10第1天59.65±7.49 59.82±5.25 59.45±7.03 59.48±6.60第2天57.03±7.37 61.91±5.69 57.23±7.11 58.01±7.12第3天51.37±7.11 59.05±6.58 52.00±7.12 53.29±7.32 54.08±7.13 45.76±7.12#47.58±7.27#

表2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)游泳距離的比較(s,m)

表2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)游泳距離的比較(s,m)

注：與空白組比較，■■P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

1.6.2 蛋白免疫印跡法（western blot）

每組其余5只小鼠取新鮮海馬組織，將海馬組織迅速研磨，加入含100 μg·ml-1的蛋白裂解緩沖液50 μl，4℃裂解10 min，然后行4℃離心15 min，12000 rpm，吸取上清。Bradford法測(cè)定組織蛋白含量。采用5%的濃縮膠與10%的分離膠4℃過(guò)夜；行SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)移到PVDF膜；轉(zhuǎn)膜后以5%PBS-T脫脂奶粉封閉，室溫震蕩60 min。封閉結(jié)束后，PBS洗膜2次。加入一抗GFAP抗體（以1∶1000稀釋?zhuān)覝胤跤^(guò)夜。PBS洗膜，3×15 min。用辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗孵育60 min，PBS洗膜，3×15 min。將PVDF浸入ECL（1∶1混）孵育，室溫20℃，5 min。使用X光片曝光，常規(guī)方法顯影定影，采用SPSS19.0軟件分析掃描后膠片目的條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 不同電針對(duì)SAMP8快速老齡化小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，各組小鼠的逃避潛伏期都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。與空白組相比，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明8月齡SAMP8快速老齡化小鼠模型成功，其具有明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。與模型組相比，音樂(lè)電針組和脈沖電針組逃避潛伏期縮短，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）（表1）。

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

與空白組相比，模型組的游泳距離顯著增長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明8月齡的SAMP8快速老齡化小鼠記憶保持力差。音樂(lè)電針組和脈沖電針組較模型組游泳距離縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

2.2 GFAP星形膠質(zhì)細(xì)胞在小鼠海馬CA1區(qū)免疫組化結(jié)果

海馬CA1區(qū)GFAP免疫組織化學(xué)染色，其神經(jīng)元陽(yáng)性表達(dá)情況如圖所示，陽(yáng)性神經(jīng)元以海馬CA1區(qū)表達(dá)最為明顯，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)體積較大，多呈蜘蛛狀，以胞漿表達(dá)為多見(jiàn)，偶可見(jiàn)胞核表達(dá)。空白組海馬CA1區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較少；模型組海馬CA1區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增過(guò)，且顏色深染，突起增長(zhǎng)；音樂(lè)電針組和脈沖電針組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較模型組減少（圖1）。

圖1 各組小鼠海馬CA1區(qū)GFAP蛋白表達(dá)

圖2 各組小鼠海馬CA1區(qū)GFAP平均光密度比較（s，n=5）

圖3 各組小鼠海馬GFAP蛋白的表達(dá)情況

圖4 各組小鼠海馬GFAP相對(duì)表達(dá)量比較（s，n=5）

與空白組對(duì)比，模型組海馬CA1區(qū)GFAP平均光密度明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組對(duì)比，音樂(lè)電針組和脈沖電針組小鼠海馬CA1區(qū)GFAP平均光密度有明顯下降趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01），但與脈沖電針組對(duì)比，音樂(lè)電針組GFAP平均光密度減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖2）。

2.3 各組小鼠海馬CA1區(qū)GFAP蛋白Western blot的表達(dá)結(jié)果

與空白組小鼠對(duì)比，模型組小鼠海馬GFAP蛋白條帶明顯增粗，顏色加深，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；與模型組對(duì)比，音樂(lè)電針組和脈沖電針組小鼠海馬GFAP蛋白條帶表達(dá)明顯變淺，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；音樂(lè)電針組小鼠海馬GFAP蛋白條帶表達(dá)較脈沖電針組明顯變淺，寬度變窄，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖3、圖4）。

3 討論

阿爾茨海默病屬于中醫(yī)的“癡呆”范疇，其病在腦。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“頭為諸陽(yáng)之會(huì)”，腦為“元神之府”，位貫脊中，充填于腦。《甲乙經(jīng)·卷二》曰：“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦，上巔循額至鼻柱，陽(yáng)脈之海也”。因此督脈的主干與分支均與腦聯(lián)系密切，故素有“病變?cè)谀X，首取督脈”之說(shuō)。曹瑾[11]提出基于“督脈—腦—神”生理與病理上的密切關(guān)系，用“通督啟神”法治療“腦”相關(guān)的精神神志類(lèi)疾病。“通督啟神”法以“百會(huì)”、“印堂”、“人中”三穴為主要穴位。“百會(huì)”，位于巔頂，又名三陽(yáng)五會(huì)，能通達(dá)陰陽(yáng)脈絡(luò)；“印堂”，位于兩眉正中，功能鎮(zhèn)驚醒神；“人中”，位于鼻柱下，醒神開(kāi)竅，主治諸多精神疾患。三穴同用，共奏“通督啟神”之效。

電針療法是指針刺刺入人體穴位得氣后，通過(guò)輸入中低頻脈沖電流，加強(qiáng)對(duì)穴位的刺激作用，但后期常因機(jī)體對(duì)其產(chǎn)生耐受性而療效減退。音樂(lè)電針具有腧穴刺激和音樂(lè)治療的雙重作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示[12]，音樂(lè)本身可通過(guò)聲波的傳導(dǎo)，增加海馬組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的含量，增加海馬內(nèi)興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA的表達(dá)，改善神經(jīng)元形態(tài)和可塑性，起到鎮(zhèn)靜安神的作用，且音樂(lè)電針可將音樂(lè)節(jié)律轉(zhuǎn)化為不同的頻率和刺激強(qiáng)度，使其隨音樂(lè)節(jié)律的變化而變化，克服了普通脈沖電針的耐受性缺點(diǎn)，在治療老年性癡呆等神經(jīng)精神疾病中取得了較好療效[13-14]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocytes，AS）廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)所占比重最大的細(xì)胞群體，在應(yīng)對(duì)損傷產(chǎn)生的刺激時(shí)，能合成和分泌多種細(xì)胞因子，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子[15]，為神經(jīng)元提供能量代謝底物，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和免疫反應(yīng)。在AD患者腦中，星形膠質(zhì)細(xì)胞可能具有雙向作用，一方面，AS可通過(guò)清除Aβ淀粉樣沉積和限制炎癥在大腦的傳播起到保護(hù)神經(jīng)元的作用[16]，同時(shí)，從活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)可誘導(dǎo)腦中的神經(jīng)變性及退化，誘導(dǎo)炎癥和神經(jīng)毒性因子的額外釋放，加速神經(jīng)元的變性和死亡[17]，但是AS活化時(shí)對(duì)神經(jīng)元的損害作用占明顯優(yōu)勢(shì)[18]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的中間絲成分，對(duì)神經(jīng)生理功能和各種病理過(guò)程具有重要作用，并被廣泛作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[19]。研究表明，神經(jīng)元退化變性時(shí)海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥應(yīng)答明顯增加，炎性因子的活性增強(qiáng)[20]。最新研究表明，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞為AD患者診斷的重要炎性病理標(biāo)記物，例如Taipa R等在研究中通過(guò)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)AD患者海馬CA1區(qū)AS反應(yīng)顯著增高[21]。國(guó)內(nèi)學(xué)者相關(guān)研究也表明，在AD模型小鼠中，海馬區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多，面積增大，學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低[22-23]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，音樂(lè)電針和脈沖電針均可改善AD癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，但音樂(lè)電針對(duì)改善學(xué)習(xí)記憶獲取能力有優(yōu)于脈沖電針的趨勢(shì)，而兩者對(duì)空間位置探索記憶作用相當(dāng)；在抑制GFAP蛋白表達(dá)方面，兩種電針均可以明顯減少海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)，且與脈沖電針組對(duì)比，音樂(lè)電針組小鼠海馬GFAP表達(dá)減少,表明電針治療可以降低小鼠海馬GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，抑制活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，且音樂(lè)電針有明顯優(yōu)于脈沖電針的趨勢(shì)。電針抗癡呆的作用機(jī)制復(fù)雜多樣，通過(guò)減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制炎癥因子對(duì)神經(jīng)元的損害，以起到保護(hù)神經(jīng)元作用可能是針刺抗癡呆的作用途徑之一，這為今后的臨床研究奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。